Questo video mostra le procedure per la caratterizzazione di isole pancreatiche umane utilizzando ematossilina ed eosina (H & E) e di immunoistochimica (IHC). Sezioni del pancreas di testa, corpo, e le regioni di coda sono macchiati sia da H & E e IHC per determinare la composizione delle isole endocrine (insulina, glucagone e polipeptide pancreatico), la replicazione cellulare (Ki67), e infiltrati infiammatori (H & E, CD3). La regione uncinato è localizzato usando IHC per il polipeptide pancreatico.
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Articolo metodologico
Protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le stime di superficie delle isole e dei numeri e la composizione delle cellule endocrine nel pancreas umano adulto varia da alcune centinaia di migliaia di intervalli di massa diversi milioni di beta e da 500 a 1-3 mg 1500. Con questa eterogeneità noto, un trattamento standard e procedura di colorazione è stato sviluppato in modo che le regioni del pancreas sono stati chiaramente definiti e isolotti caratterizzate con rigorosa istopatologia ed esami immunolocalizzazione.
Procedure standardizzate per l'elaborazione di pancreas umano recuperati da donatori di organi sono descritte nella parte 1 di questa serie. Il pancreas è trasformato in 3 regioni principali (testa, corpo, coda) seguiti da sezioni trasversali. Sezioni trasversali della testa del pancreas sono ulteriormente suddivise, come indicato in base alle dimensioni, e numerati in ordine alfabetico per indicare sottosezioni. Questa standardizzazione permette una completa analisi sezione trasversale della regione della testa, compresa la regione uncinato che contiene composti isolottiprincipalmente da cellule pancreatiche polipeptide regione della coda.
La presente relazione comprende parte 2 di questa serie e descrive le procedure utilizzate per il sezionamento seriale e caratterizzazione istopatologica delle sezioni di paraffina del pancreas con un'enfasi sulle cellule endocrine insulari, la replica e T-cellule si infiltra. Patologia delle sezioni pancreatiche è destinata a caratterizzare sia esocrina, dei dotti, e componenti endocrine. Il vano esocrina viene valutato per la presenza di pancreatite (attivo o cronica), atrofia, fibrosi, e grasso, così come il sistema di condotto, in particolare in relazione alla presenza di neoplasia pancreatica intraduttale 4. Le isole vengono valutati per la morfologia, le dimensioni e densità, cellule endocrine, infiammazione, fibrosi, amiloide, e la presenza di cellule replica o apoptotici con H & E e le macchie IHC.
Il componente finale descritta nella parte 2 è la fornitura della diapositiva macchiatas come immagini delle diapositive digitalizzate intere. Le diapositive digitalizzate sono organizzati per caso e regione pancreas in un database online patologia la creazione di una biobanca virtuale. L'accesso a questa raccolta online è attualmente previsto a oltre 200 medici e scienziati coinvolti nella ricerca sul diabete di tipo 1. Il database online fornisce un mezzo per la rapida e completa condivisione dei dati e per i ricercatori per selezionare i blocchi di paraffina o congelati sezioni seriali.
Protocollo
1. Microtomia per sezioni non macchiate
- Impostare bagnomaria e microtomo come per microtomia paraffina standard. Utilizzare vetrini con carica positiva e pre-etichetta con il numero di casi, regione pancreas (campione) e il numero di diapositiva. Posto blocco di paraffina nel mandrino microtomo con l'etichetta cassetta sul lato sinistro.
- Seguire le procedure Microtomia normali, sezione nel blocco finché il tessuto è uniformemente incontrato. Produrre un nastro di sezioni seriali (4 micron di spessore, 3-6 a seconda del numero di macchie iniziali richiesti (vedi Modulo per l'invio Case, appendice 1)). Sezioni distinte nell....
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Discussione
Standardizzazione delle procedure IHC è fondamentale per l'analisi delle immagini, in particolare quando si utilizzano computer basati su algoritmi in un gran numero di diapositive nel corso del tempo. La procedura di colorazione IHC descritto nella presente relazione permetterà un'analisi lotto di campioni di un donatore data, utilizzando uno Autostainer all'interno di una giornata di 8 ore di lavoro e vengono modificati da una relazione precedente 5. Immagini delle diapositive digitalizzate inte.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano le famiglie dei donatori e le Organizzazioni Organ Procurement coinvolti in questa ricerca e Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, Roshan e Agarwal per la loro assistenza di un esperto. Questo lavoro è stato finanziato dalla Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) a sostegno della rete per i donatori di organi del pancreas con diabete.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| 30% perossido di idrogeno (H 2 O 2) | FisherScientific | H325-500 | Perossidasi endogena blocco |
| ABC-fosfatasi alcalina (AP) | Vettore | AK-5000 | AP coniugato |
| Anticorpo Diluente | Invitrogen | 003218 | Anticorpo primario |
| Avidina blocker | Vettore | SP-2001 | Blocca biotina endogena |
| Biotinilato di capra anti-cavia | Vettore | BA-7000 | Anticorpo secondario |
| Reagente blu | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
| Tampone citrato, pH 6,0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen recupero |
| Chiarificatore 1 | FisherScientific | 7401 | Leica Autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mezzo di montaggio |
| DAB | Vettore | SK-4100 | HRP cromogeno |
| Deeb | DAKO | S2003 | Endogena AP blocco reattivo |
| Eosina alcolica Y | FisherScientific | 71204 | Leica Autostainer |
| Etanoli-100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Vario | Deparaffinizzazione e coprioggetto |
| Ematossilina | DAKO | S3301 | Dako Autostainer |
| Ematossilina 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica Autostainer |
| IgG (tutte le specie di accoglienza per gli anticorpi primari) | Vario | Vario | I controlli negativi per le primarie |
| Liquid Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP cromogeno |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Capra anti-topo coniugato AP |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Capra anti-topo coniugato HRP |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Capra anti-topo coniugato HRP |
| Metanolo | FisherScientific | Vario | H 2 O 2 diluente |
| Siero di capra normale | Vettore | S-1000 | IHC blocco reattivo |
| Cecchino | Biocare Medical | BS966M | IHC blocco reattivo |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC tampone |
| Triology 20x | Cella Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xilene | FisherScientific | Vario | Deparaffinizzazione e coprioggetto |
Tabella 1. Reagenti specifici.
| Anticorpo primario | Host specie | Venditore | Cat. # | Commenti e recupero Antigen |
|---|---|---|---|---|
| Paraffina | ||||
| Amilasi | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrato |
| Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrato |
| L'anidrasi carbonica 19,9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
| Caspasi-3, scisso | Coniglio | Segnalazione cellulare | 9961 | Citrato o Trilogy |
| CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrato o Trilogy |
| CD3 | Coniglio | DAKO | A0452 | Citrato |
| CD34 | Mouse | Segnalazione cellulare | 3569 | Citrato |
| CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrato |
| CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrato |
| CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrato |
| CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrato |
| Cromogranina A | Coniglio | DAKO | A0430 | Citrato |
| CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrato |
| CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrato |
| CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrato |
| C-peptide | Coniglio | Segnalazione cellulare | 4593 | Citrato |
| Foxp3 | Ratto | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrato |
| Grelina | Capra | Santa Cruz | SC-10386 | |
| Grelina | Coniglio | Abcam | ab85104 | |
| Glucagone | Coniglio | DAKO | A0565 | |
| Glucagone | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrato |
| Glucagone | Cavia | Bachem | T-5037 | Citrato |
| GLUT-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogia |
| GLUT-2 | Coniglio | Santa Cruz | SC-9117 | Non espresso in isole umane |
| Insulina | Cavia | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrato |
| CFP | Coniglio | Novus biologica | NB400-137A | Trilogia |
| Polipeptide pancreatico | Coniglio | Invitrogen | 18-0043 | Citrato |
| PDX-1 | Cavia | Abcam | ab47308 | Citrato o Trilogy |
| Proinsulina | Mouse | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| Proinsulina | Mouse | Developmental Studies ibridoma Bank | GS-9A8 | Citrato |
| Secretagogin | Coniglio | Sigma | HPA 006641 | Citrato |
| Actina del muscolo liscio | Coniglio | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatina | Coniglio | DAKO | A0566 | |
| Sinaptofisina | Mouse | DAKO | M0776 | Citrato |
| Freschi congelati | Host specie | Venditore | Cat. # | Comments |
| CD11b | Ratto | Abcam | ab6332 | Fissare con il 4% PF |
| CD11c | Coniglio | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | Mouse | Novus biologica | NB 600-564 | Utilizzare una notte di incubazione per le sezioni di paraffina |
| CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fissare con acetone |
| GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130569 | Fissare con il 4% PF |
| HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fissare con acetone o 4% PF |
Tabella 2. Anticorpi primari.
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
|---|---|---|---|
| Aperio Scanscope CS | Aperio | Diapositive scanner digitale | |
| DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC macchie | |
| Label Matrix software di stampa | BioCarta | LM7UP57 | Presentazione dell'etichetta del software |
| Leica XL Autostainer | Leica | H & E le macchie | |
| Premium vetrino | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner software | |
| SuperFrost Plus scivola | FisherScientific | 12-550-15 | Vetrini con carica positiva |
| Verdure a vapore | Black and Decker | Vario | Antigen recupero |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Diapositiva stampante di etichette |
Tabella 3. Forniture e attrezzature specifiche.
Riferimenti
- In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008). ....
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Ristampe e permessi
