Transmembrana della fibrosi cistica regolatore conduttanza (CFTR), un canale cloruro epiteliale, è stata riportata per interagire con varie proteine e regolano importanti processi cellulari, tra i quali i CFTR PDZ motivo mediate da interazioni sono stati ben documentati. Questo protocollo descrive i metodi che abbiamo sviluppato per assemblare un PDZ-dipendente macromolecolare CFTR segnalazione complessa In vitro.
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Articolo metodologico
L'analisi in vitro dei complessi CFTR PDZ-dipendenti macromolecolari di segnalazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Transmembrana della fibrosi cistica regolatore della conduttanza (CFTR), un canale del cloro si trova soprattutto a livello delle membrane apicali delle cellule epiteliali, gioca un ruolo cruciale nella omeostasi del liquido transepiteliale 1-3. CFTR è stata implicata in due importanti malattie: fibrosi cistica (CF) 4 e 5 secretoria diarrea. In CF, la sintesi o attività funzionale della CFTR Cl-canale è ridotta. Questo disturbo colpisce circa 1 su 2500 caucasici negli Stati Uniti 6. Attività eccessiva CFTR è stata anche implicata in casi di tossina indotta diarrea secretoria (ad esempio, da tossina del colera e stabile al calore enterotossina E. coli) che stimola la produzione di cAMP o cGMP nell'intestino 7.
Accumulare le prove suggeriscono l'esistenza di interazioni fisiche e funzionali tra CFTR e un numero crescente di altre proteine, tra trasportatori, canali ionici, recettori, chinasi, fosfatasi, segnalemolecole zione ed elementi del citoscheletro, e queste interazioni tra CFTR e le sue proteine leganti hanno dimostrato di essere criticamente coinvolte nella regolazione CFTR trasporto mediato transepiteliale ionico in vitro e in vivo 8-19. In questo protocollo, ci concentriamo solo sui metodi che gli aiuti nello studio delle interazioni tra CFTR carbossile terminale della coda, che possiede una proteina di legame motivo [denominato PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], e un gruppo di proteine scaffold, che contengono un modulo di legame specifico denominato domini PDZ. Finora, molte diverse proteine PDZ ponteggi sono stati riportati da associare alla coda terminale carbossile di CFTR con affinità diverse, ad esempio, i NHERF1 NHERF2 e PDZK1 e PDZK2 e CAL (CFTR-associata ligando), Shank2, e GRASP 20-27. Il motivo PDZ all'interno CFTR che è riconosciuto da PDZ proteine scaffold è ultimi quattro amminoacidi al C terminale (cioè, 1477-DTRL-1480 in umano CFTR) 20. Interessante,CFTR può legare più di un dominio PDZ sia NHERFs e PDZK1, pur in diversi affinità 22. Questa polivalenza rispetto CFTR legame ha dimostrato di essere di importanza funzionale, suggerendo che le proteine PDZ impalcatura può facilitare la formazione di complessi macromolecolari CFTR segnalazione per la segnalazione specifici / selettivo ed efficace in cellule 16-18.
Più saggi biochimici sono stati sviluppati per studiare CFTR, che coinvolge interazioni proteiche, come la co-immunoprecipitazione, pull-down assay, pair-wise saggio di legame, colorimetrico pair-wise saggio di legame, e il dosaggio di assemblaggio macromolecolare complessa 16-19,28,29 . Qui ci concentriamo sulle procedure dettagliate di assemblaggio di un motivo PDZ CFTR-dipendente contenenti macromolecole complesse in vitro, che è ampiamente utilizzato dal nostro laboratorio per studiare proteina-proteina o di dominio nel dominio delle interazioni che coinvolgono CFTR 16-19,28,29.
Protocollo
1. Espressione e purificazione di proteine ricombinanti in batteri Fusion etichettate
- Amplifica le regioni definite del C-code (gli ultimi 50-100 aminoacidi contenenti i motivi PDZ a C-terminale) per CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR, e NHERFs (full-length o PDZ1 o PDZ2 domini ) con approccio PCR.
- Clonare i prodotti di PCR in pGEX4T-1 vettore per le proteine di fusione GST-(come GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), pMAL-C2 vettore per MBP-fusione proteine (come MBP-β 2 AR CT, MBP-CFTR CT ), e per i Suoi pET30-S-proteine di fusione (come la sua-S-CFTR CT, His-S-PDZK1).
- Trasforma in una proteasi carente di ....
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Discussione
In questo protocollo abbiamo dimostrato un metodo in vitro per l'assemblaggio e il rilevamento di una CFTR contenente complesso macromolecolare segnalazione utilizzando proteine purificate (o frammenti di proteine) e / o lisati di cellule come riportato precedentemente 16-19,29,30. Per ottenere i migliori risultati i seguenti punti critici durante il processo di preparazione richiedono una particolare attenzione:
- È importante che il pH del tampone di eluizione essere regolata a 8,0.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Il nostro lavoro è stato supportato anche da finanziamenti American Heart Association (Greater Southeast Affiliate) Inizio-grant-in-aiuto 0765185B, la Fondazione U. Pardee Elsa assegno di ricerca, e Wayne State University intramurale del fondo di avvio e Cardiovascular Research Institute premio Initiative Isis. Questo metodo di assemblaggio in vitro complesso macromolecolare CFTR è stata originariamente introdotta da Dr. AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| pGEX4T-1 vettore | GE Healthcare | 28-9545-49 | già Amersham Biosciences |
| pMAL-C2 vettoriale | New England BioLabs | ||
| pET30 vettore | EMD Chemicals | 69077-3 | ex Novagen |
| Glutatione agarosio perline | BD Biosciences | 554780 | |
| Amilosio resina | New England BioLabs | E8021S | |
| Talon perline | Clontech | 635501 | |
| glutatione ridotto | BD Biosciences | 554782 | |
| imidazolo | Pescatore | BP305-50 | |
| maltosio | Pescatore | BP684-500 | |
| S-proteina agarosio | EMD Chemicals | 69704-3 | ex Novagen |
| Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
| Anti-IgG CFTR | Su misura | R1104 | mAb riconoscendo CFTR epitopo al aa 722-734 |
| Anti-IgG MRP2 | Chemicon International | MAB4148 | Ora una parte di Millipore |
Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche.
Riferimenti
- Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
- Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance r....
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Ristampe e permessi
