Isolamento di embrionale cresta neurale dal tubo neurale facilita l'uso di In vitro Metodi per lo studio della migrazione, self-renewal, e multipotenza di cresta neurale.
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Articolo metodologico
Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il embrionale cresta neurale (NC) è una popolazione di cellule progenitrici multipotenti che si origina nel lato dorsale del tubo neurale, subisce un epitelio di transizione mesenchimale (EMT) e migra in tutta l'embrione, dando luogo a diversi tipi di cellule 1-3. NC ha anche la capacità unica di influenzare la differenziazione e la maturazione degli organi bersaglio 4-6. Quando espiantato in vitro, progenitori NC sottoposti a self-renewal, migrare e differenziarsi in una varietà di tipi di tessuto compresi i neuroni, glia, cellule muscolari lisce, cartilagine e osso.
Multipotenza NC è stata descritta da espianti del tubo neurale aviaria 7-9. In isolamento in vitro di cellule NC facilita lo studio delle dinamiche NC, compresa la proliferazione, la migrazione e multipotenza. Ulteriori attività nei sistemi di aviaria e nel ratto hanno dimostrato che le cellule espiantati NC mantengono il loro potenziale NC, quando trapiantati in embrione 10-13. Poiché queste proprietà intrinseche cellulari sono conservati in espiantati progenitori NC, il saggio di espianto del tubo neurale fornisce un'opzione interessante per lo studio della NC in vitro.
Per ottenere una migliore comprensione del mammifero NC, molti metodi sono stati impiegati per isolare popolazioni NC. NC-derivati progenitori può essere coltivato da posizioni post-migratori, sia l'embrione e adulti per studiare la dinamica di post-migratori progenitori NC 11,14-20, tuttavia l'isolamento di cellule progenitrici NC in quanto emigrano dal tubo neurale fornisce la migliore conservazione dei NC potenzialità e le proprietà delle cellule migratorie 13,21,22. Alcuni protocolli impiegano fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) per isolare una popolazione NC arricchito per progenitori particolari 11,13,14,17. Tuttavia, quando a partire da embrioni in fase iniziale, il numero di cellule sufficienti per le analisi sono difficili da ottenere con FACS, complicando l'isolamento dei primi NC populations da embrioni individuali. Qui, descriviamo un approccio che non si basa su FACS ed i risultati in una popolazione di circa il 96% NC puro basato su un Wnt1 Cre-giornalista attivato lignaggio 23.
Il metodo presentato qui è l'adattamento di protocolli ottimizzati per la cultura di ratto NC 11,13. I vantaggi di questo protocollo rispetto ai precedenti metodi che sono 1) le cellule non sono cresciute su uno strato alimentatore, 2) FACS non è necessaria per ottenere una popolazione relativamente puro NC, 3) NC premigratory cellule vengono isolate e 4) risultati sono facilmente quantificato. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per l'isolamento di NC da qualsiasi modello di topo mutante, facilitando lo studio delle caratteristiche NC con diverse manipolazioni genetiche. Il limite di questo approccio è che il NC viene rimosso dal contesto dell'embrione, che è noto per influenzare la, migrazione sopravvivenza e la differenziazione del NC 2,24-28.
Protocollo
1. Preparazione Piastre
- Utilizzare la tecnica sterile in ogni momento.
- Preparare fibronectina (FN) diluendo 100 pl di plasma umano archivio di FN in un volume finale di 3,3 ml in PBS di Dulbecco (DPBS). Concentrazione finale è di 30 ug / ml e questo può essere conservato a 4 ° C per 1 settimana.
- Coprire fondo di ciascun pozzetto di una sterile coltura tissutale quattro piastre con soluzione FN e lasciate riposare per 15 minuti. Assicurarsi che l'intera superficie è coperta. Assicurarsi che il supporto durante questo periodo (punti 2 e 3).
- Rimuovere FN soluzione e consentire piastre asciugare. Lavare delicatamente i pozzett....
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Discussione
Particolare attenzione dovrebbe essere prestata alla fase di sviluppo dell'embrione per assicurare il successo di questo approccio. Contando somiti di embrioni di topo primi è fondamentale sia per la fase di adattamento embrioni all'interno di una cucciolata e la determinazione delle regioni corrette di tubo neurale per l'isolamento. Una variazione di uno o due somiti tra embrioni è entro una gamma ragionevole di temporizzazione di sviluppo, a seconda della risoluzione dell'esperimento condotto. Un embri.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere Marc Wozniak per l'assistenza video. Vorremmo inoltre ringraziare Sean Morrison del Southwestern per il protocollo originale per la coltura di cellule di ratto NC. Questo lavoro è stato supportato Vanderbilt University Medical Support programma Academic Center e da sovvenzioni da parte del NIH (HD36720 e HD036720-11S109) e il 11GRNT7690040 AHA a PAL, borse predoctoral della AHA (0615209B) e NIH (NS065604) a NAM, e ERP è stato sostenuta da una sovvenzione del NIH di formazione T32HD007502.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| DMEM (glucosio basso) | Gibco / Invitrogen | 11885 | |
| Media Neurobasal | Gibco | 21103 | |
| BSA | Sigma | A3912-10G | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Conservare in 50 ug / mL aliquote a -20 ° C. |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Conservare in 25 ug / ml aliquote a -20 ° C. |
| Fibronectina | Gibco | 33016-015 | Conservata nella 1mg/mL aliquots a -20 ° C. |
| L'acido retinoico | Sigma | R2625 | Conservare a 35 mcg / ml aliquote dopo ricostituzione in etanolo a -20 ° C. |
| 2-mercaptoetanolo | Sigma | D-5637 | |
| N 2 integratore | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplemento | Gibco | 17504-044 | |
| Steriflip 0,22 micron filtri | Millipore | SCGP00525 | |
| Penicillina-streptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| 0,20 micron filtri | Corning | 431219 | |
| Siringhe (per filtrazione) | BD Biosciences | 301604 | |
| Quattro pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| Collagenasi / dispasi | Roche | 269 638 | Attività varia a seconda del lotto. Conservare in 100 mg / mL aliquote a -20 ° C. |
| Insulina aghi (Calibro 29 ½) | Becton Dickson | 309306 | |
| Camera di ipossia | Billups-Rothenberg | ||
| Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg | ||
| Pinza # 5 | Strumenti di Scienze Belle | Per la rimozione di utero e decidua. | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200 |
Riferimenti
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
- Saint-Jeannet, J. -P.
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Ristampe e permessi
