Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari

Sommario

Un protocollo per la preparazione di robusti, piccoli estratti HeLa nucleari viene descritto. Questo protocollo è importante per i saggi che richiedono l'uso di piccole popolazioni di cellule, come cellule trattate con farmaci o RNAi. Il metodo dovrebbe essere applicabile ad un'ampia varietà di analisi di espressione genica e altri tipi cellulari, incluse cellule del paziente.

Abstract

Una grande quantità di progressi nella comprensione dell'espressione genica è stato realizzato utilizzando sistemi in vitro. Per la maggior parte degli studi, saggi funzionali vengono effettuate utilizzando estratti che sono preparati in massa da 10-50 o più litri di cellule coltivate in sospensione. Tuttavia, queste grandi preparazioni non sono suscettibili di rapido test in vitro effetti derivanti da una varietà di trattamenti cellulari in vivo o condizioni. Questo articolo video di giornale mostra un metodo per preparare funzionali estratti nucleari piccola scala, utilizzando le cellule HeLa come esempio. Questo metodo viene effettuata utilizzando sole tre piastre da 150 mm di cellule cresciute in monostrati aderenti. Per illustrare l'efficienza dei piccoli estratti, si dimostra che essi sono attivi come bulk estratti nucleari per accoppiati RNA polimerasi II trascrizione / splicing reazioni. Per dimostrare l'utilità del protocollo estratto, si dimostra che splicing è abolito in estratti preparati da cellule HeLas trattati con il farmaco inibitore E7107 splicing. La piccola scala protocollo dovrebbe essere generalmente applicabile a qualsiasi processo o tipo di cellula che può essere studiato in vitro con estratti cellulari. Questi includono le cellule dei pazienti che sono disponibili solo in quantità limitate o cellule esposte a numerosi agenti come la droga, gli agenti che danneggiano il DNA, RNAi, o di trasfezione, che richiedono l'uso di popolazioni cellulari di piccole dimensioni. Inoltre, piccole quantità di cellule appena coltivate sono convenienti e / o richiesto per alcune applicazioni.

Protocollo

1. Le cellule HeLa in crescita per l'estrazione del nucleare

1. Cellule HeLa piastre su tre piastre da 150 mm con DMEM mezzo supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina. Crescere in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO ₂ fino a quando le cellule sono al 90% confluenti.

Tip-Split cellule 1:10 da un piatto confluenti e del raccolto 3 giorni dopo la divisione.

Tip-Un posto aggiuntivo può essere coltivata in caso non vi sono abbastanza cellule con tre piastre (per esempio, se le cellule sono meno del 90% confluenti).

2. Preparare Chill-Solutions estratto nucleare

1. Preparare le soluzioni fresche come indicato nella Tabella 2.
2. Aliquotare 10 ml di tampone ipotonico in una provetta da 15 ml Falcon. Aliquotare 1 ml di tampone di sale e 1 ml di Buffer Low Salt in 1,5 ml provette Eppendorf. Raffreddare i buffer sul ghiaccio. Aggiungere i volumi appropriati di PMSF e DTT per ogni buffer immediatamente prima dell'uso (vedi

3. Raccolta di cellule HeLa per estrazione nucleare

1. Aspirare supporti dalle cellule e le cellule lavate una volta con 13 ml di temperatura ambiente 1X PBS per piastra.
2. Aspirare il lavaggio PBS.

Tip-Aspirare tanto del PBS come possibile aspirante primo, poi in piedi la piastra su un lato, attendere qualche secondo, ed aspirando il resto.

3. Utilizzo di un sollevatore cella, raschiare le cellule al bordo inferiore delle piastre, e poi trasferire le cellule ad un tubo Eppendorf. Evita di fare le bolle. Le 3 piastre di cellule raschiate dovrebbe inserirsi in una provetta 1,5 ml Eppendorf.

Tip-È facile stimare il volume di celle se una provetta Eppendorf viene utilizzato. Per la scala, usare tubi Falcon.

4. Centrifugare a 4 ° C in una microcentrifuga per 5 min a 100 xg per agglomerare le cellule.

4. Swell cellule HeLa in tampone ipotonico

Aspirare accuratamente la PBS dalla cella pellet e stimare l'ematocrito (PCV), cercando in la gradazione sul tubo. Tre piastre confluenti di cellule HeLa producono circa 500 microlitri di PCV.

Aggiungi 2X il PCV di tampone ipotonico al pellet cellulare. Agitare delicatamente per risospendere le cellule. Utilizzare un Pipetman P1000 per risospendere le cellule delicatamente pipettando su e giù, se necessario.

Centrifugare a 4 ° C in una microcentrifuga per 5 min a 100 xg per agglomerare le cellule. * Le cellule hanno iniziato a gonfiarsi da questo momento, e il volume cellulare dovrebbe essere di circa 750 pl-1000 pl.

Aspirare accuratamente la Buffer ipotonica e aggiungere nuovi buffer ipotonico ad un volume finale di 1,5 ml. Risospendere le cellule.

Incubare le cellule risospese gonfi su ghiaccio per 10 min.

5. Lyse celle usando un omogeneizzatore Dounce

1. Utilizzare tampone ipotonico per sciacquare il Dounce e poi raffreddare sul ghiaccio. Pulire a secco con un pestello WIP delicato compitoer (es Kimwipe). Rimuovere il buffer rimanente dal Dounce utilizzando una punta di 1.000 ul micropipetta estesa.
2. Trasferire le cellule gonfie nella Dounce. Spostare lentamente il pestello stretta del Dounce su e giù per 5 volte per lisare le cellule, facendo attenzione a evitare le bolle.
3. Saggio per la lisi delle cellule usando Un'aliquota di 5 microlitri di cellule dalla Dounce. Posizionare l'aliquota in un tubo Eppendorf e aggiungere un volume uguale di Trypan Blue. Mettere il composto su un vetrino ed esaminare le cellule con un microscopio ottico. I nuclei delle cellule lisate apparirà blu. Circa il 90% lisi è l'ideale.

Tip-Il numero di volte delle cellule deve essere dounced varierà a seconda della tenuta del Dounce. Nell'effettuare tale protocollo per la prima volta, determinare il numero di volte per Dounce effettuando passo 5,3 dopo ogni corsa con la Dounce. Non esagerare con Dounce, douncing eccessiva distruggerà i nuclei.

4. Trasferire le cellule lisate in un pre-chilled tubo Eppendorf e rotazione in una microcentrifuga a 4 ° C per 5 min a 1500 x g. Il pellet contiene i nuclei. Con attenzione trasferire il surnatante in una nuova provetta senza interrompere i nuclei. Il supernatante contiene il citoplasma.

Tip-Il citoplasma può essere utilizzato così com'è o ulteriormente lavorato per uno S100 utilizzando lo stesso ad alta velocità di centrifuga usata per gli estratti di bulk (cfr. ¹ per preparare uno attivo S100 da estratti di bulk).

6. Salt-Estrarre il Nuclei

1. Stimare il volume al sacco nucleare (PNV), cercando in la gradazione sul tubo. Una PCV di 500 pl produce tipicamente una PNV di 400 microlitri.
2. Aggiungere ½ X PNV di tampone sale insufficiente alla nuclei inserendo una punta micropipetta al fondo della provetta e lentamente spruzzando il buffer in nuclei mentre delicatamente miscelazione. Non pipettare su e giù. Delicatamente a scatti i tubi per assicurarsi che il pellet è completamente risospeso nel tampone di sale basso prima di continuare.
3. Add ½ X PNV di tampone di sale e mescolare velocemente 1 volta invertendo il tubo. Non agitare. Ruota a 4 ° C per 30 min.

Tip-Sii gentile con i nuclei quando sono in Buffer di sale per evitare la loro lisi.

4. Spin a 4 ° C in una microcentrifuga per 15 min a 18.000 x g. Il surnatante è l'estratto di sale nucleare (HS-NE). Tre lastre di cellule genere permette di ottenere 500-600 microlitri di HS-NE.

7. Concentrato e Dializzare l'estratto nucleare

1. Trasferire 500 pl del HS-NE in refrigerati mini-centricons (Amicon) e centrifuga per 50 minuti a 4 ° C in una microcentrifuga a 14000 x g. Invertire la mini-centricon (Amicon) e collocarlo in una nuova provetta Eppendorf. Spin per 2 min a 4 ° C 1000 xg per recuperare l'HS-NE. La HS-NE saranno concentrate a circa 115 microlitri.
2. Utilizzando una Pipetman P200, trasferire 45 aliquote pl della HS-NE in mini-dialisi Slide-A-Lyzers, e metterli in 500 ml di tampone di dialisi refrigerata. Assicurarsi che il fondo della Slide-A-Lyzer è allineato con la parte inferiore del corpo galleggiante. Mescolare per 1-2 ore a 4 ° C. La NE avrà un aspetto torbido dopo la dialisi.

Tip-Non centrifugare per rimuovere il precipitato torbido che viene osservata dopo dialisi, in quanto questa centrifugazione riduce l'attività dell'estratto.

3. La NE può essere usata immediatamente o aliquote. Aliquote dovrebbe essere lampo congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. Il NE possono essere memorizzati e sottoposti ad almeno due cicli gelo-disgelo senza perdere attività.

8. Risultati rappresentativi

Recentemente, efficienti sistemi in vitro per l'accoppiamento RNAP trascrizione II di splicing sono stati sviluppati ^2-5. Questi sistemi impiegati coltivate cellule HeLa in massa e quindi non sono suscettibili di rapido testare gli effetti di specifici trattamenti cellulari su più campioni. Sulla base di questo bisognond l'utilità generale di un piccolo estratto di protocollo (vedi discussione), abbiamo stabilito un solido metodo di piccola scala nucleare estratto. I dati rappresentativi del confronto RNAP II trascrizione / splicing reazione in piccola scala estratto nucleare con l'estratto bulk nucleare è mostrato in Figura 2. Un costrutto di DNA-CMV, che contiene il promotore CMV e codifica un substrato splicing standard (FTZ ^3, Figura 2A) è stato utilizzato per l'analisi. Quando questo costrutto è stato incubato nella massa (corsie 1-3) o di piccole dimensioni (corsie 4-6) estratto, livelli simili di nascente del pre-mRNA sono stati sintetizzati dal punto 5 min Tempo (figura 2, corsie 1 e 4 ). Dopo aggiunta di α-amanitina per bloccare la trascrizione ulteriormente, gli intermedi di giunzione e prodotti giuntate accumulata nel tempo con cinetiche simili in entrambi i tipi di estratti (figura 2, corsie 2, 3, 5, 6). Questi risultati rappresentativi mostrano che l'efficienza del colpo led RNAP II trascrizione / splicing sistema è simile negli estratti rinfusa e su piccola scala nucleari.

Per dimostrare l'utilità della piccola scala metodo estratto, estratti sono stati preparati da cellule HeLa trattati con l'inibitore splicing, E7107, o il composto di controllo negativo pladienolide F ^6,7 e quindi accoppiata RNAP II trascrizione / splicing saggio è stato effettuato. Come mostrato in figura 3, trascrizione da RNAP II verificato efficientemente estratti preparati sia dal Pladienolide F E7107 e cellule trattate (10 punti temporali min). Al contrario, si è verificato splicing normalmente l'estratto preparato dalle cellule trattate con F Pladienolide ma è stata abolita in E7107 cellule trattate (Figura 3, 20-60 punti di tempo min). Questi dati forniscono la prova di concetto per l'utilizzo degli estratti nucleari di piccole dimensioni per il trattamento speciale di cellule in piccola scala.

jpg "/>
Figura 1. Schema di piccola scala protocollo Extract. Punto P1. Le cellule sono coltivate come monostrati, raccolto da piastre con un sollevatore di cella e gonfiato con l'aggiunta di tampone ipotonico. Passo P2. Le cellule sono lisate usando un omogeneizzatore Dounce e centrifugato a pellet nuclei. Passo P3. I nuclei sono separati dal citoplasma e subiscono estrazione del sale. Passo P4. L'estratto nucleare viene concentrata e dializzato. Passo P5. I risultati si ottengono che mostrano che gli estratti nucleari sono funzionali (vedi figura 2 per maggiori dettagli).

Figura 2. Estratti nucleari di piccole dimensioni sono robuste in un RNAP accoppiato II trascrizione / splicing saggio. A. Schematica del CMV-DNA FTZ template utilizzato per accoppiamento RNAP II trascrizione / splicing. Il promotore CMV e le dimensioni degli esoni e introni sono indicati. Confronto B. accoppiato RNAPII trascrizione / splicing test utilizzando l'estratto di massa nucleare o su piccola scala estratto nucleare. α-amanitina è stato aggiunto dopo 5 minuti di trascrizione e di splicing è stata lasciata avvenire per 30 e 60 min. RNA è stato estratto e frazionato su un gel di poliacrilammide denaturante al 5% e rilevato da phosphoimager. Gli intermedi di giunzione ed i prodotti sono indicati. Il endogeno U6 snRNA e tRNA presenti nell'estratto e che sono ³² P-marcato durante l'incubazione sono indicati. Vedere ³ per un protocollo dettagliato sul RNAP accoppiato II trascrizione / splicing del sistema.

Figura 3. Estratti nucleari piccola scala preparati da cellule HeLa trattati con il farmaco inibitore E7107 splicing sono difettosi in splicing. Cellule sono state trattate con 3 Pladienolide pM o F E7107 comedescritto ⁶ e poi utilizzata per preparare estratti nucleari piccola scala. Un decorso di tempo è stata effettuata utilizzando la stessa trascrizione / splicing saggio come in Figura 2. Gli intermedi di giunzione e dei prodotti, e snRNA U6 e tRNA sono indicati.

Discussione

Abbiamo stabilito un metodo rapido e riproducibile per la preparazione di estratti nucleari di piccole quantità di cellule HeLa come monostrati coltivate. Abbiamo dimostrato che questi estratti sono robusti, mostrando che la cinetica e l'efficienza delle RNAP II trascrizione / saggi di splicing sono simili negli estratti di piccole dimensioni e massa nucleari. Abbiamo mostrato l'utilità degli estratti dimostrando che estratti preparati da cellule trattate con un farmaco inibitore della giunzione sono attivi per la trascrizione ma difettoso in splicing.

Il metodo per preparare estratti nucleari piccola scala è stata stabilita mediante la combinazione e l'ottimizzazione dei metodi precedentemente stabiliti per rendere estratti di cellule HeLa coltivate in sospensione in larga scala ^1,8 e un metodo per la piccola preparazione di estratti ^9. Abbiamo stabilito il protocollo perché i precedenti piccola scala estratti non erano funzionali per alcuni saggi, come la trascrizione accoppiata / splicing saggio. Una differenza importante tra la precedente piccola scala protocollo ⁹ e la nostra è che abbiamo ottimizzato le condizioni per la lisi delle cellule utilizzando un mini-Dounce mentre il precedente protocollo lisate le cellule spingendo attraverso un piccolo ago di calibro ^9. L'ago-lisi risultati in bolle, che possono spiegare perché gli estratti sono stati inattivi e / o difficili da riprodurre per alcuni saggi. Abbiamo anche aggiunto una fase di concentrazione al nostro protocollo. Questo passaggio aumenta l'attività degli estratti, che sono estremamente sensibili alla concentrazione, e limita anche la variabilità tra estratti che è inerente ai piccoli preparazioni. Infine, la preparazione viene usualmente effettuata con solo tre piastre da 150 mm di cellule monostrato, senza alcun effetto significativo sull'attività rispetto al estratti rinfusa. Pertanto, la procedura è facilmente recuperabili per i piccoli preparazioni che richiedono reagenti costosi o la disponibilità cellulare limitata. Per esempio, abbiamo preparato small scala estratti da cellule atterramento RNAi e da leucemia linfocitica cronica (CLL), le cellule del paziente, questi estratti e utilizzati per le prove funzionali e / o biochimici (EGF, JLH, TY e RR, inedito). Abbiamo scoperto che gli estratti sono preziose per RNAi seguita da specifici saggi biochimici quali immunopreciptations, western e la colorazione d'argento. Dopo aver stabilito l'efficacia di abbattere una proteina particolare, uno studio più dettagliata può essere effettuata facendo un atterramento linea cellulare stabile, che può essere utilizzato per preparare estratti supplementari a costi inferiori. La spettrometria di massa di proteine ​​presenti in immunoprecipitati ottenuti da queste linee cellulari smontabili sarà anche una utile applicazione del metodo. Oltre al accoppiato trascrizione / splicing saggio che abbiamo usato come esempio per la descrizione di protocollo qui, i piccoli estratti dovrebbe essere generalmente applicabile a numerosi saggi funzionali e biochimici, come quelli utilizzati per la st diversieps di espressione genica (es. capping, splicing, trascrizione, poliadenilazione, elaborazione microRNA). Il protocollo può anche essere adattato per tipi di cellule di pazienti che possono essere ottenuti sia in sospensione (come le cellule CLL) o in coltura (quali fibroblasti paziente). Infine, la frazione citoplasmatica ottenuta durante la procedura sia utile per i saggi funzionali e biochimiche che richiedono il citoplasma.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Nome e cognome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
HEPES	4 - (2-idrossietil) piperazin-1-etansolfonico	Sigma	H3375-500G
MgCl 2 .6 H 2 O	Di cloruro di magnesio esaidrato	Sigma	M2670-500G
KCl	Cloruro di potassio	Pescatore	P335-212
PMSF	Fluoruro Phenylmethanesulfonyl	Sigma	P7626-100G
DTT	Ditiotreitolo	Americano Bioanalytical	AB00490-5G
EDTA	Etilendiamminotetracetato, sodio, diidrato	Americano Bioanalytical	AB00500-01000
Glicerina		MP Biomedicals	800689
DMEM	Media Minimal Essential Dulbecco	Invitrogen	11995-073
FBS	Siero fetale bovino	Gibco	16140
Penicillina / streptomicina		Gibco	15070
PBS	Soluzione tampone fosfato	Cellgro	21-040-CV
Trypan Blue Stain 0,4%		Gibco	15250
Sollevatori cellulari		Corning	29442-200
Piatti 150mm		VWR	353025
Estesa Micropipetta Tip		Denville	P1126
Dounce omogeneizzatore, 1 ml, con pestello stretta		Wheaton	357538
Slidealyzers, MWCO 10kDa		ThermoScientific	69572
Mini-Centricons, MWCO 3kDa		Millipore (Amicon)	UFC500396

Soluzione	Finale	Stock	Dispensare
Ipotonica	HEPES 10 mM, pH 7,9	HEPES 1M, pH 7,9	5 ml
	1,5 mM MgCl 2	1M MgCl 2	750 microlitri
	10 mM KCl	3M KCl	1,67 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM PMSF	500 pl
	0,5 mM DTT	2M DTT	125 microlitri
			Portate fino a 500 ml con acqua
Salt Basso	HEPES 20 mM, pH 7,9	HEPES 1M, pH 7,9	2 ml
	1,5 mM MgCl 2	1M MgCl 2	150 pl
	20 mM KCl	3M KCl	667 microlitri
& Nbsp;	0,2 mM EDTA	0.5M EDTA	40 microlitri
	25% Glicerina	Glicerina	25 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM PMSF	100 pl
	0,5 mM DTT	2M DTT	25 pl
			Portare a 100 ml con acqua
Sale alta	HEPES 20 mM, pH 7,9	HEPES 1M, pH 7,9	2 ml
	1,5 mM MgCl 2	1M MgCl 2	150 pl
	1.4M KCl	3M KCl	48 ml
	0,2 mM EDTA	0.5M EDTA	40 microlitri
	25% Glicerina	Glicerina	25 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM PMSF	100 pl
	0,5 mM DTT	2M DTT	25 pl
			Portare a 100 ml con acqua
Dialisi	HEPES 20 mM, pH 7,9	HEPES 1M, pH 7,9	10 ml
	100 mM KCl	3M KCl	16,625 ml
	0,2 mM EDTA	0.5M EDTA	200 pl
	20% Glicerina	Glicerina	100 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM PMSF	500 pl
	0,5 mM DTT	2M DTT	125 microlitri
			Portate fino a 500 ml con acqua