Un In vitro Modello per lo studio genetico della rigenerazione assonale adulte di topo in coltura con neuroni dei gangli della radice dorsale è descritto. Il metodo comprende una fase re-suspension/re-plating per consentire assoni ricrescita di neuroni sottoposti manipolazione genetica. Questo approccio è particolarmente utile per la perdita di funzione studi di rigenerazione degli assoni usando RNAi-based knockdown proteine.
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Articolo metodologico
Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari
In questo articolo
Sommario
Abstract
È noto che i neuroni maturi nel sistema nervoso centrale (CNS) non può rigenerare loro assoni dopo lesioni per diminuita capacità intrinseca di supportare la crescita assonale e un ambiente ostile in 1,2 maturo CNS. Al contrario, i neuroni maturi nel sistema nervoso periferico (PNS) rigenerare facilmente dopo lesioni 3. Adulti dei gangli della radice dorsale (DRG) i neuroni sono ben noti per rigenerare robusto dopo lesioni dei nervi periferici. Ogni neurone DRG cresce uno assone dal soma cellulare, che si dirama in due rami assonali: un ramo periferico innerva bersagli periferici e un ramo centrale che si estende nel midollo spinale. Lesioni dei DRG risultati assoni periferici nella rigenerazione degli assoni sostanziale, mentre gli assoni centrali nel midollo spinale rigenerare poco dopo la lesione. Tuttavia, se la lesione assonale periferico si verifica prima della lesione del midollo spinale (un processo chiamato la lesione condizionamento), rigenerazione di assoni centrali è greatly migliorata 4. Inoltre, gli assoni dei neuroni centrali DRG condividono lo stesso ambiente ostile come discendente assoni corticospinali nel midollo spinale. Insieme, si ipotizza che i meccanismi molecolari che controllano la rigenerazione degli assoni dei neuroni DRG adulti può essere sfruttata per migliorare la rigenerazione degli assoni del SNC. Come risultato, i neuroni DRG adulti vengono ora ampiamente utilizzato come sistema modello per studiare la crescita assonale rigenerativa 5-7.
Qui si descrive un metodo di coltura adulto DRG neurone che possono essere utilizzati per lo studio della rigenerazione assonale genetica in vitro. In questo modello i neuroni DRG adulti sono geneticamente manipolati tramite elettroporazione trasfezione mediata gene 6,8. Trasfettando neuroni con DNA plasmidico o SI / shRNA, questo approccio permette sia di guadagni e perdite di funzione esperimenti per studiare il ruolo di ogni gene d'interesse in crescita degli assoni dai neuroni DRG adulti. Quando i neuroni sono trasfettate con SI / shRNA, la proteina endogena è miratadi solito dopo 3-4 giorni impoverito nella cultura, durante i quali il tempo robusta crescita degli assoni è già verificato, rendendo la perdita di funzione studi meno efficace. Per risolvere questo problema, il metodo qui descritto comprende una risospensione e ri-placcatura passo dopo trasfezione, che permette di assoni ricrescere dai neuroni in assenza della proteina mirata. Infine, forniamo un esempio di utilizzo di questo modello in vitro per studiare il ruolo di un gene associato rigenerazione degli assoni, c-Jun, a mediare la crescita degli assoni dei neuroni DRG da adulto 9.
Protocollo
1. Preparazione di vetrini coprioggetti, terreno di coltura, e enzimi digestivi
- Il 12-mm tondo # 1 vetrini vengono utilizzati per la coltura neuronale. Le coprioggetti vengono puliti con il 10% HCL notte seguito da lavaggio ad ultrasuoni con acqua distillata deionizzata e per 3 volte (20 minuti / tempo). Le coprioggetti puliti sono memorizzati in etanolo 70% per un uso futuro. Prima di ogni sperimentazione, i coprioggetti sono dotate di aria essiccata e inseriti nella piastra di coltura.
- Per rivestire le coprioggetti secchi, 100 pl di soluzione di rivestimento contenente 100 pg / ml di poli-D-lisina e 10 ug / ml soluzione laminina lavoro viene ag....
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Discussione
Adulti neuroni DRG rigenerare i loro assoni robusta dopo lesioni dei nervi periferici in vivo e in vitro, fornendo così un sistema utile per studiare la rigenerazione degli assoni negli animali adulti. Coltura in vitro di neuroni DRG adulti sta diventando un metodo ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi molecolari attraverso i quali la rigenerazione degli assoni è regolamentata. La procedura in vitro di neuroni adulti, la coltura del mouse DRG qui presentato consente una rapi.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni a favore di FZ dal NIH (R01NS064288) e Craig H. Neilsen Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-lisina bromidrato | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Laminina | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-desossiuridina | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Uridina | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| Collagenasi A | Roche | 10103578001 | |
| Triplo espresso | Invitrogen | 12604-013 | |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillina-streptomicina (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Vetrini coprioggetto (# 1) | Scienze della microscopia elettronica | 72196-12 | |
| 24 e piastra di coltura cellulare | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| PBS 1X | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, acqua distillata e deionizzata | Mediatech | 25-055-CV | |
| Kit Nucleofector ed elettroporazione per i neuroni del mouse | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA contro c-Jun | Dharmacon | L-043.776 | |
| Anticorpo anti - tubulina βIII (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Prolungare Antifade soluzione oro di montaggio | Invitrogen | P36930 |
Riferimenti
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D.
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Ristampe e permessi
