Un approccio rapido per investigare le interazioni e gli effetti sui meccanismi molecolari legati alla presenza di anticorpi in un ambiente intracellulare viene descritto. Il metodo comporta la transfezione di anticorpi nelle cellule vive utilizzando un non-covalente formazione del complesso basato su una formulazione lipidica. La tecnica è adattabile a linee cellulari immortalizzate e cellule primarie.
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Articolo metodologico
Trasfezione anticorpo in neuroni come strumento per studiare patogenesi della malattia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Anticorpi fornire la capacità di ottenere informazioni romanzo in vari eventi che si svolgono in sistemi viventi. La capacità di produrre anticorpi altamente specifici per le proteine bersaglio ha consentito di questioni biologiche molto precise da affrontare. Soprattutto, gli anticorpi sono stati implicati nella patogenesi di numerose malattie umane comprendenti lupus eritematoso sistemico (SLE), artrite reumatoide (RA), sindromi paraneoplastiche, sclerosi multipla (SM) e umane T linfotropico virus di tipo 1 (HTLV-1) mielopatia associata / paraparesi spastica tropicale (HAM / TSP) 1-9. Come anticorpi causano la malattia è una zona di un'indagine in corso, ed i dati suggeriscono che le interazioni tra gli anticorpi e molecole intracellulari vari risultati in infiammazione, alterazione cellulare di messaggistica, e l'apoptosi 10. E 'stato dimostrato che i pazienti con SM e HAM / TSP produrre autoanticorpi al intracellulare di RNA binding protein proteine eterogenee ribonuclear A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Dati recenti indicano che gli anticorpi per intra-neuronale e antigeni di superficie sono patogeni 3, 5-9, 11. Pertanto, un procedimento che consente lo studio di anticorpo intracellulare: proteina presterebbe grande intuizione patogenesi della malattia.
I geni sono comunemente trasfettati in cellule primarie e linee cellulari in coltura, tuttavia trasfezione in cellule di anticorpi è stato ostacolato dalla alterazione della struttura anticorpo o scarsa efficienza di transfezione 12. Altri metodi di trasfezione includono trasfezione anticorpo basato su liposomi cationici (costituito DOTAP / DOPE) e polyethylenimines (PEI), entrambi i quali ha determinato un decremento di dieci volte nella trasfezione anticorpo rispetto ai controlli 12. Il metodo eseguito nel nostro studio è simile a lipidi cationici-mediate metodi e utilizza una base lipidica meccanismo per formare non covalenti complessi con gli anticorpi attraverso elettrostatica e hydrinterazioni ophobic 13. Abbiamo utilizzato Ab-DeliverIN reattivo, che è una formulazione lipidica in grado di catturare anticorpi attraverso interazioni elettrostatiche e idrofobi non-covalenti e depositarli all'interno delle cellule. Così chimica e genetica accoppiamenti non sono necessari per la consegna di anticorpi funzionali nelle cellule viventi. Questo metodo ci ha permesso di eseguire l'analisi degli anticorpi vari esperimenti e localizzazione della proteina, così come le analisi delle conseguenze molecolari di anticorpi intracellulari: interazioni delle proteine 9.
In questo protocollo, si mostrerà come trasfettare anticorpi in neuroni rapida, riproducibile e con un elevato grado di efficienza di trasfezione. A titolo di esempio, useremo anticorpi anti-hnRNP A1 e anti-IgG. Per la quantificazione facile di efficienza di trasfezione abbiamo utilizzato anticorpi anti-A1 hnRNP etichettati con Atto-550-NHS e marcato con FITC IgG. Atto550 NHS è una nuova etichetta ad alto assorbimento molecolare e quantistica yiELD. Fonte di eccitazione e filtri fluorescenti per Atto550 sono simili a Cy3 (Es. 556 Em. 578). Inoltre, Atto550 ha fotostabilità alta. Marcato con FITC IgG sono stati utilizzati come controllo per dimostrare che questo metodo è versatile e non tingere dipendente. Questo approccio e i dati generati aiuterà nella comprensione del ruolo che gli anticorpi per antigeni bersaglio intracellulare potrebbe svolgere nella patogenesi delle malattie umane.
Protocollo
1. Anticorpo Labeling (Figura 1)
- Fai 0.1 M NaHCO 3 buffer:
- 8,4 g NaHCO 3
- 29,2 g NaCl
- 1 litro H 2 O
- Portare il buffer fino ad un pH di 8,4 con questa soluzione (10,6 g di Na 2 CO 3, 29,2 g di NaCl, 1 litro H 2 0).
- Aggiungere 35 ul Atto550 NHS a 70 pl pl NaHCO anti-hnRNPA1 e 500 3 tampone e ruotarlo per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora di rotazione, iniettare il composto in un dializzatore e dializza in 2 litri di PBS durante la notte.
- Il giorno dopo, concentrare i dializzati Atto550 NHS anti-hnRNPA1 utilizzando una colonna di spin (Amicon Ultra 0.5).
- Dopo le Atto550 NHS marcato anti-hnRNPA1 anticorpo è stato concentrato, nano-drop campione per determinare la concentrazione.
2. Anticorpo trasfezione (Figura 2)
- Seed 10 5 cellule / pozzetto in 500 pl di Dulbecco di Eagle modificato Medio (DMEM/F12 10% FBS 1% antibiotico) in un pozzetto 8 slitta 24 ore prima della trasfezione. Confluenza cellulare deve essere almeno il 70%.
- Ventiquattro ore dopo la semina, aggiungere 2 ml di Ab-DeliverIN reagenti in una provetta Eppendorf.
- Successivamente, aggiungere 2 ug di Atto550 NHS etichettati hnRNPA1 anticorpo anti-(0,5 pg / pl) allo stesso tubo Eppendorf e incubare 10-15 min a RT.
- Durante l'incubazione, aspirare media e aggiungere 394 ml di DMEM fresco supporto alle cellule.
Nota: Aggiungere 500 microlitri DMEM ad una camera di cellule intatte per fungere da controllo.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 100 ml di DMEM alla miscela di anticorpi, mescolare pipettando su e giù, e aggiungere alle cellule in DMEM per un volume totale di 500 microlitri.
- Modificare i media dopo 48 ore di consegna anticorpi.
Nota: protocollo è stato ripetuto con FITC Rigg etichettato come controllo positivo.
3. Imaging Live e stabiliti per determinare l'efficienza
- Celle di immagine, vivono a 48 ore utilizzando i Cy3 filtro su un microscopio a fluorescenza per l'immagine del trasfettate Atto550 NHS anticorpi marcati.
- Dopo l'imaging dal vivo è stata completata, aspirare i media e le cellule fisse.
- Dopo mezzi aspiranti, il trattamento di cellule con 0,4% paraformaldeide per 15 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule 4 x 5 min ciascuna con PBS. Poi, montare cellule con mezzi di montaggio contenenti reagenti DAPI e applicare il coprioggetto correzione. Misurare l'efficienza di trasfezione delle cellule fisse con AxioVision software. Se AxioVision software non è a portata di mano, basta contare gli eventi dall'immagine i risultati a mano e inserire nel calcolo in 3.7. In alternativa, il software ImageJ può essere utilizzato per questi calcoli.
- In primo luogo, utilizzare la misurazione "Eventi" per contare il numero totale di celle nella vostra immagine di scelta un ingrandimento 20x.
- Successivamente, utilizzare la misurazione "Eventi" per contare le cellule che non eranosuccesso trasfettate con anticorpi nella stessa 20x ingrandimenti.
- Per accedere ai misurati "Eventi" in un formato stile Excel, fare clic su "Proprietà", fare clic sulla scheda "Misura", e fare clic per visualizzare "come tabella."
- Infine, utilizzare il seguente calcolo per determinare l'efficienza di trasfezione confrontando i due eventi misurate in precedenza: ((Totale cellule - cellule non trasfettate) / cellule totali) x 100 = La trasfezione di efficienza.
4. Risultati rappresentativi
Le immagini live non trasfettate (Figura 3A) rispetto al trasfettate (Figura 3B) neuroni rivelano che l'etichettatura degli anticorpi (rosso o verde in ogni figura) è chiaramente osservata nelle cellule (Figura 3B, C, D). Seguendo aspirazione e lavaggio con mezzi per rimuovere gli anticorpi o tra aderenti alla superficie delle cellule, anticorpi marcati sono ancora presenti all'interno dei neuroni (Figura 3C, D). Per calcolare l'efficienza di trasfezione, utilizzare il software AxioVision per calcolare cellule totali rispetto alle cellule che non sono state transfettate con successo. Questi valori sono stati inseriti in una formula efficienza di trasfezione di acquisire l'efficienza di trasfezione come percentuale di cellule totali (Figura 4).
Figura 1. Diagramma di flusso delle procedure utilizzate per gli anticorpi etichette con la 550 Atto NHS estere seguita da passaggi necessari per concentrare gli anticorpi marcati. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Diagramma di flusso delle procedure utilizzate per trasfettare anticorpi marcati nelle cellule vive in coltura.arge.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 3. Immagini in diretta dei neuroni trasfettati trasfezione 48 ore di seguito.
Figura 4. Fisso e risciacquati immagini con eventi contati per determinare l'efficienza di trasfezione.
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Discussione
Al fine di verificare ipotesi circa molecole specifiche e la loro espressione, altri geni e vettori sono comunemente trasfettati in cellule. L'aspetto unico di questo procedimento è la possibilità di trasfettare facilmente anticorpi nelle cellule bersaglio. Abbiamo eseguito questo metodo in cinque esperimenti separati ciascuno in duplicati. Risultati di efficienza di trasfezione erano simili in tutti gli esperimenti. Soprattutto, il metodo permette l'inserimento di anticorpi nella cellula senza alterare la strut...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dall'Ufficio di Ricerca e Sviluppo, Ricerca medica Service, Department of Veterans Affairs. Questo studio è stato finanziato da un premio VA recensione Merit (per MCL) e la University of Tennessee Health Science Fondo sclerosi multipla Research Center.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| Fluorescente Microscopio AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| AxioVision versione 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| Marcato con FITC anti-Rigg | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS estere | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS antibiotici +1% | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lisina 8 pozzetti Cultura Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientifico Industries Inc | Modello 151 | |
| DAPI Montaggio supporti | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dializzatore | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldeide (4% soluzione) | Scienze della microscopia elettronica | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
Riferimenti
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