Un basso Rat modello di mortalità per valutare ritardata vasospasmo cerebrale dopo emorragia subaracnoidea sperimentale

Sommario

Emorragia subaracnoidea aneurismatica (SAH) è il sanguinamento che si verifica nello spazio subaracnoideo quando una rottura dell'aneurisma. Mentre la morbilità e la mortalità di questo evento è stato su un declino a causa di migliori approcci terapeutici, il rischio di vasospasmo dopo emorragia subaracnoidea continua ad essere la stessa che era diversi anni fa. L'importanza della creazione di un modello animale completo e riproducibile per identificare gli eventi scatenanti di vasospasmo cerebrale è stato al centro di ricerche sin dal primo utilizzo di ratti in un modello sperimentale di vasospasmo nel 1979 da Barry Et al. I primi lavori nei ratti ha dimostrato che una singola iniezione di sangue autologo nella cisterna magna portato a acuta (entro pochi minuti), ma non in ritardo vasospasmo cerebrale ^{3, 6, 14}. Qui caratterizzare una bassa mortalità modello di ratto SAH che si traduce in riproducibili vasospasmo ritardato.

Abstract

Obiettivo: caratterizzare e stabilire un modello riproducibile che dimostra in ritardo vasospasmo cerebrale dopo emorragia subaracnoidea aneurismatica (SAH) nei ratti, al fine di individuare gli eventi scatenanti, i cambiamenti fisiopatologici e target potenziali per il trattamento.

Metodi: Ventotto maschi Sprague-Dawley (250-300 g) sono stati arbitrariamente assegnati ad uno dei due gruppi - SAH o controllo salino. Emorragia subaracnoidea ratto nel gruppo SAH (n = 15) è stata indotta mediante doppia iniezione di sangue autologo, 48 hr a parte, nella cisterna magna. Analogamente, soluzione salina normale (n = 13) è stato iniettato nella cisterna magna del gruppo di controllo salina. Ratti sono stati sacrificati al giorno cinque dopo l'iniezione e sangue secondo i cervelli sono stati conservati per l'analisi istologica. Il grado di vasospasmo è stata misurata utilizzando sezioni dell'arteria basilare, misurando l'area in sezione trasversale interna luminale utilizzando NIH Image-J software. Il significato eratestato con Tukey / Kramer 's l'analisi statistica.

Risultati: Dopo l'analisi delle sezioni istologiche, basilare superficie luminale dell'arteria sezione trasversale erano più piccole in SAH rispetto al gruppo salina, coerente con vasospasmo cerebrale nel primo gruppo. Nel gruppo SAH, zona interna dell'arteria basilare (0,056 micron ± 3) erano significativamente più piccole da vasospasmo cinque giorni dopo l'iniezione di sangue secondo (sette giorni dopo l'iniezione di sangue iniziale), rispetto al gruppo di controllo salina con area interna (0,069 ± 3, p = 0,004). Non ci sono stati casi di mortalità da vasospasmo cerebrale.

Conclusione: Il doppio ratto induce una lieve emorragia subaracnoidea, capaci di mantenersi, vasospasmo dell'arteria basilare che può essere utilizzato per studiare i meccanismi fisiopatologici di vasospasmo cerebrale in un modello animale di piccole dimensioni. Un tasso di mortalità basso e accettabile è un criterio significativo per essere soddisfatti per un ideale modello animale SAH in modo che i meccanismi di vasospasmo può essere elucidated ^{7, 8.} Ulteriori modifiche del modello può essere fatto per regolare la maggiore gravità del vasospasmo e gli esami neurologici.

Protocollo

1. Chirurgia per Rat Oggetto SAH iniettato con 0,15 ml di sangue autologo arteriosa

1. Il ratto è anestetizzato con 0,1 mg / kg di ketamina / TMA cocktail roditore e lasciata riposare per 5 min.
2. Anestesia adeguata è confermato dalla riduzione di riflesso degli arti posteriori.
3. L'utilizzo di un rasoio elettronico un collo al naso zona di capelli intorno al sub-occipitale è rasata.
4. L'animale viene posto supino sul tavolo operatorio e la coda è deterso con Betadine per garantire una incisione sterile.
5. Un diritto da 1 centimetro linea mediana incisione è assunto l'aspetto ventrale della coda
6. La dissezione è prorogata fino l'arteria coda è identificato e isolato.
7. Utilizzando una sterile 26-gauge catetere, l'arteria coda è cannulata e 0,15 ml di sangue arterioso viene aspirata in una siringa.
8. Una garza sterile viene avvolto intorno alla incisione per assicurare emostasi prima dell'applicazione del vetbond per sigillare l'incisione.
9. Tratto si è attivata prono sul tavolo e la zona rasata sul sub-occipitale è deterso con betadine.
10. Utilizzo di un accesso verticale incisione mediana si ottiene l'cisterna magna.
11. Una volta identificato un ago calibro 25 è inserito nella cisterna magna e 0,15 ml di CSF viene prelevata con una siringa per evitare maggiori pressioni intracranici con iniezione di volume di sangue autologo.
12. Ora, il 0,15 ml di sangue estratto dall'arteria coda viene iniettata lentamente in cisterna magna.
13. L'ago rimane in posizione per 30 sec per garantire la coagulazione nello spazio subaracnoideo e poi estratto con cautela.
14. L'emostasi è assicurata e l'incisione viene chiusa con un dispositivo di pinzatura.
15. L'animale è ora posizionato prono su una superficie di riscaldamento con una testa 20 ° verso il basso la posizione per 20 min per permettere al sangue di coagularsi nelle cisterne intorno dell'arteria basilare.
16. Passi 1,1-1,15 si ripetono nel corso del secondo intervento 48 ore di distanza.

2. Chirurgia per Rat Oggetto SAH iniettato con 0,15 ml di soluzione salina

1. Il ratto è anestetizzato con 0,1 mg / kg di ketamina / TMA cocktail roditore e lasciata riposare per 5 min.
2. Anestesia adeguata è confermato dalla riduzione di riflesso degli arti posteriori.
3. L'utilizzo di un rasoio elettronico un collo al naso zona di capelli intorno al sub-occipitale è rasata.
4. L'animale viene posto supino sul tavolo operatorio e la coda è deterso con Betadine per garantire una incisione sterile.
5. Un diritto da 1 centimetro linea mediana incisione è assunto l'aspetto ventrale della coda
6. La dissezione è prorogata fino l'arteria coda è identificato e isolato.
7. Utilizzando una sterile 26-gauge catetere, l'arteria coda è cannulata e 0,15 ml di sangue arterioso viene aspirata in una siringa.
8. Una garza sterile viene avvolto intorno alla incisione per assicurare emostasi prima dell'applicazione del vetbond per sigillare l'incisione.
9. Il rat è attivata prona sul tavolo e la zona rasata sul sub-occipitale è verniciato con betadine.
10. Utilizzo di un accesso verticale incisione mediana si ottiene l'cisterna magna.
11. Una volta identificato un ago calibro 25 è inserito nella cisterna magna e 0,15 ml di CSF viene prelevata con una siringa ed il campione viene memorizzato.
12. Ora, il 0,15 ml di soluzione salina normale (37 ° C) viene iniettata lentamente in cisterna magna.
13. L'ago viene lasciato in sede per 30 sec e estratto con cautela.
14. L'emostasi è assicurata e l'incisione viene chiusa con un dispositivo di pinzatura.
15. L'animale è ora posizionato prono su una superficie di riscaldamento con una testa 20 ° verso il basso la posizione per 20 min.
16. Passi 2,1-2,15 si ripetono nel corso del secondo intervento 48 ore di distanza.

3. Rat Sacrificio

1. Il giorno 5 dopo il secondo intervento chirurgico, i ratti vengono sacrificati mediante perfusione cardiaca.
2. Il ratto è dato una dose letale (00,2 ml / kg) di Fatal Plus (Vortech PHARMACEUTICALS LTD., Dearborn, MI)
3. Con una incisione mediana verticale, la cavità addominale viene raggiunta e il peritoneo è aperto.
4. Una toracotomia anteriore viene eseguita e il cuore è esposto.
5. Utilizzando un 26-gauge catetere collegato ad una soluzione di tampone fosfato (PBS pH 7,4 ea 37 °), l'animale viene svuotato di sangue e viene poi perfusi con paraformaldeide al 4%.
6. Dopo garantendo un'adeguata perfusione, la perfusione viene arrestata e il ratto viene portata al tavolo decapitazione.
7. Dopo decapitazione, un rongeur osso viene utilizzato per rimuovere il cranio per la rimozione del cervello.
8. Il cervello e del tronco cerebrale sono accuratamente estratta dalla volta cranica e posto in una soluzione di paraformaldeide 4% e conservata a 4 ° C per 48 ore.

4. Creazione di sezioni per valutare vasospasmo

1. Il cervello di ratto che è stato immerso in 30% saccarosio per 4 giorni è portato a thcriostato e per il sezionamento.
2. Una volta crioprotetti, 12 sezioni di m sono creati utilizzando il criostato, con l'anteriore arteria cerebellare inferiore (AICA) come punto di partenza per garantire la coerenza tra soggetti.
3. 20 sezioni vengono creati per ogni animale, che termina a livello dell'arteria cerebellare superiore (SCA).
4. Le sezioni sono posti su un vetrino e valutati per vasospasmo con metodologia istologica

Risultati

Entro i protocolli descritti sopra, ci sono diversi passaggi che riteniamo richiedono una migliore caratterizzazione del modello di quello che è stato descritto precedentemente in letteratura. Qui ci concentriamo sui passi che sono essenziali al fine di ottenere una bassa mortalità riproducibile cerebrale modello animale piccolo vasospasmo ed evitare potenziali problemi associati a questo modello se non effettuate correttamente.

1. Il sangue autologo Draw dal Arteria Tail:

Discussione

Primati, con una composizione più simile genetica e caratteristiche anatomiche per l'umano, più strettamente imitare gli eventi di ritardo vasospasmo cerebrale e possono più facilmente subire non invasiva per immagini (risonanza magnetica e angiografia) per monitorare i cambiamenti delle arterie, che roditori ^8. Tuttavia, i modelli di primati sono un costo proibitivo e associato con cura più complessa e le questioni etiche, di modelli animali di piccole dimensioni. Piccoli animali SAH modelli che sono sta...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome di attrezzature / reagente	Azienda	Numero di catalogo
Ratti maschi SD (250-300 g)	Taconic	SD-M
26 g Cateteri	Webster	8416683
25 G Aghi	Bufalo	305122
1 cc Siringhe	Negozi centrali	54245
La ketamina / Xylazina cocktail	Animal Care (SUNY) *	-
Betadine	Negozi centrali	51458
Saccarosio	Sigma	S9378-1kg
Paraformaldeide	Sigma	P6148-500G
Soluzione tampone fosfato	Pescatore	BP-399-4
Tavolo operatorio	Harvard	PY2 72-2590
Ottobre composto (crioprotezione)	VWR	25608-930
SuperFrost diapositive	Pescatore	12-550-15

* Sintetizzato presso il Dipartimento di cura degli animali da laboratorio, SUNY Upstate Medical University. Aggiungere 1 cc [100 mg / ml] di DBU a 10 ml [100 mg / ml] di Ketamina.