On-Chip Fenotipizzazione Endothelial infiammatoria

Sommario

Camere di flusso Microfluidic incisi da fotolitografia e fabbricati da PDMS sono applicate per sondare gli esiti funzionali associati alla disfunzione CE e l'infiammazione. In un esperimento rappresentativo, la capacità di sforzo di taglio differenziale di modulare l'adesione cellulare monocitica di citochina attivato CE monostrati è dimostrata.

Abstract

Aterogenesi è potenziato da alterazioni metaboliche che contribuiscono ad un elevato stato di infiammazione sistemica con conseguente disfunzione endoteliale. Tuttavia, i primi cambiamenti funzionali dell'endotelio che indicano il livello individuale di rischio non sono direttamente valutato clinicamente per aiutare strategia terapeutica guida. Inoltre, la regolazione di infiammazione emodinamica locali contribuisce alla non casuale distribuzione spaziale di aterosclerosi, ma i meccanismi sono difficili da delineare in vivo. Descriviamo un approccio lab-on-a-chip basato su test di quantitativamente perturbazione metabolica di eventi infiammatori nelle cellule endoteliali umane (CE) e dei monociti in condizioni di flusso precise. Metodi standard di litografia soft sono usati per microfabricate vascolari camere mimetici microfluidica (VMMC), che sono legati direttamente alla coltura monostrati CE. ¹ Questi dispositivi hanno il vantaggio di utilizzare piccoli volumi di reagenti, mentrefornendo una piattaforma per l'imaging direttamente gli eventi infiammatori a livello della membrana di CE esposto ad un ben definito campo di taglio. Abbiamo applicato con successo questi dispositivi per indagare citochine, lipidi ^{2-3, 4} e ⁵ RAGE indotta infiammazione in umano aortica CE (HAEC). Qui documentare l'uso della cella VMMC di dosaggio monocitiche (THP-1) laminazione e arresto su monostrati HAEC che sono condizionati alle caratteristiche di taglio differenziali e attivato dalla citochina infiammatoria TNF-α. Studi come questi stanno fornendo informazioni meccanicistica in atherosusceptibility in caso di fattori di rischio metabolici.

Protocollo

1. Di coltura cellulare e Preparazione del substrato

1. Tagliare supporti circolari da 3 pollici da una x 100 20 piatto di coltura tissutale mm (BD Falcon) usando un tornio. Sterilizzare substrati mediante immersione in etanolo al 70%. Posto in una capsula di Petri e mantello con 4 ml di collagene di tipo I (100 pg / ml) per 1 ora a temperatura ambiente, poi lavare con 4 ml 1 x PBS.
2. Sospendere Le cellule endoteliali aortiche (HAEC, passaggio 4-6) a 6.5x10 ⁵ cellule / ml e di sementi mediante l'applicazione di 1 ml direttamente al substrato. Posto a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore e permettere alle cellule di aderire al substrato per 1 h.
3. Aggiungere 9 ml di crescita endoteliale Medio-2 (EGM-2) integrato con 1x antibiotico-antimicotico soluzione alle cellule. Modificare i media ogni 2 giorni fino a quando le cellule raggiungere il 90% di confluenza.
4. Mantenere cellule THP-1 in mezzo RPMI 1640 integrato con 10% FBS e 1x antibiotico-antimicotico soluzione. Cellule Passage quando raggiungono una densità di 10 ⁶ cellule / ml.

2. Cella Shearing protocollo

Le cellule sono condizionati in un costume cono-and-piastra di dispositivo a cella Shearing (CSD). Dettagli del dispositivo e specifiche di progetto sono documentati nella Tabella 1 e Figura 4.

1. Preparare il CSD. Sterilizzare l'alloggiamento camera con etanolo e risciacquare con PBS sterile. Riscaldare l'alloggiamento a 37 ° C e livello per assicurare che il cono è perpendicolare al monostrato cellulare. Assemblare il substrato con le cellule dal fondo del contenitore e impostare il cono all'altezza desiderata.
2. Utilizzare Leibovitz-15 (L-15) mezzo supplementato con BulletKit Endothelial come mezzo di taglio per mantenere il pH corretto in assenza di CO _2. Per stimolare infiammazione, aggiungere fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) al mezzo di taglio e iniettare 6 ml nel dispositivo tramite una siringa collegata ad una porta di ingresso, avendo cura di non introdurre ariabolle nella camera.
3. Cellule di taglio ad un elevato sforzo di taglio grandezza costante (HSS, 15 dyne / cm ²⁾ o una sollecitazione di taglio oscillatoria (OSS, 0 ± 5 dyne / cm ^2, 1 Hz) per 4 ore. La SS desiderato si ottiene ruotando il cono di sopra delle celle, che è controllato con precisione con un micro-motore a passo, come precedentemente descritto ⁶ La parete SS in superficie (τ _w) è approssimata da.:
   
   dove μ è la viscosità del mezzo, ω è la velocità angolare del cono, e α è l'angolo del cono (0,5 °). L'allineamento cono con il substrato viene regolata entro 0,05 ° attraverso il livellamento di precisione e l'altezza gap fissato a 20 ± 10 micron utilizzando un calibro di profondità per ridurre al minimo variazione circonferenziale e radiale in τ _w. Il dispositivo è stato convalidato per garantire caratteristiche di flusso laminare. Rimuovere cells dal dispositivo e preparare l'analisi di adesione dei monociti.

3. Fabbricazione di PDMS Microfluidic Camera

1. Ottenere stampo master per numero di canale desiderato microfluidica e l'altezza del canale a seconda dell'applicazione. Le caratteristiche del disegno specifico utilizzato in questo protocollo sono dettagliati nella Tabella 1. Il metodo per creare questi è già ben documentata in letteratura. ¹ In breve, la rete di canali è progettato utilizzando software CAD (Autodesk Inventor) e stampato a 5000 dpi su una trasparenza. Fotoresist negativo (SU8) viene filata su un wafer di silicio ad uno spessore di 100 um. La trasparenza è sovrapposta ed esposto alla luce UV. Non polimerizzato photoresist viene rimosso per generare la matrice positiva replica.
2. Per rendere la soluzione base di silicone PDMS mix con silicone agente di indurimento a 10:01 in peso in una barca a pesare e mescolare con una pipetta 5 ml sierologico. Fare attenzione a non grattare le paretidel peso della barca per evitare di aggiungere fiocchi di plastica per la soluzione.
3. Posizionare il wafer master in un piatto 100x15mm Petri e versare la soluzione PDMS nel piatto.
4. Coprire il piatto e metterla in un contenitore vuoto per 15 minuti per rimuovere le bolle. Dopo 15 minuti prendere la piastra di Petri e rimuovere le bolle in eccesso delicatamente soffiando aria sulla superficie.
5. Porre la capsula Petri in un forno per 1 ora a 70 ° C. Rimuovere il piatto e tagliare le camere microfluidici utilizzando una lama affilata.

4. Montaggio del dispositivo sul microscopio

1. Accendere sorgente di luce al microscopio invertito e impostare riscaldamento a 37 ° C. Collegare il tubo di una siringa da 10 ml e riempirlo con acqua distillata in modo tale che non ci siano bolle. Posizionare la siringa nella pompa a siringa e portata impostata per indurre una parete di SS 1 dyne / cm ^2. La sollecitazione di taglio parete (τ _w) generata lungo la mezzeria del canale è approssimata utilizzando lo standardequazione per un parallelo-plate camera di flusso:
   
   dove μ è la viscosità del mezzo, Q è la portata volumetrica, h è l'altezza del canale, e w è la larghezza del canale. Nota: poiché i canali sono di larghezza finita effettivo τ _w varia con w seconda del canale rapporto di aspetto, e le misurazioni vengono evitati al 25% più vicino alle pareti laterali. ^1,7
2. Posizionare PDMS camera in acqua e utilizzare una micropipetta 100 microlitri per rimuovere aria dai singoli canali. Collegare l'alimentatore alla camera a vuoto facendo attenzione che la valvola è disattivata.
3. Porre Petri con monostrato HAEC rispetto all'obiettivo. Posizionare la camera di PDMS sulla piastra di Petri e cautela impostato sul monostrato HAEC, assicurando che non si formano bolle d'aria tra il dispositivo e il monostrato. Ruotare la valvola in modo che il vuoto è acceso e la camera è fissato saldamente.
Tagliare 19 aghi calibro smorzare tale che ci sia solo 5 mm di sinistra metallo. Riempire il serbatoio di plastica con il tampone e mettere in ingresso PDMS camera. Ripetere per appropriato numero di canali da utilizzare. Collegare il tubo dalle pompe siringa per PDMS uscite canale.

5. Adesione Assay monociti sotto stress Shear

1. Sospensione cellule THP-1 a 2x10 ⁶ cellule / ml in HBSS + Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} + HSA 0,1%. Attivazione cellule THP-1 mediante incubazione con stromale fattore-1 derivato (SDF-1, 50 ug / ml) per 15 min a temperatura ambiente.
2. Accendere pompa a siringa per stabilire un flusso, quindi si aggiungono 50 microlitri di sospensione cellulare al serbatoio senza introdurre bolle d'aria. Quando il flusso è completamente sviluppato, iniziare l'acquisizione dei dati.
3. Eseguire per 5 min a velocità di flusso del caso, aggiungendo tampone al serbatoio se la soluzione diventa bassa. Continuare tampone scorre nei canali per lavare le cellule non legate nella corrente di flusso.

6. Acquisizione dati e analisi

1. Acquisire sequenze di immagini digitali a 3 fotogrammi / s per 2 min a seguito del flusso pienamente sviluppata lungo l'asse longitudinale del canale a 3 posizioni nel canale, facendo attenzione a non registrare immediatamente dopo l'ingresso o prima o porte di uscita 25% in più vicina al lato pareti.
2. Contare il numero di cellule arrestate per campo identificando loro fase aspetto brillante nello stesso piano focale del monostrato.
3. Cell arresto impresa è definita dal movimento

7. Risultati rappresentativi

Anche se l'endotelio vascolare è uniformemente esposta agli agonisti che contribuiscono a infiammazione sistemica, l'aterosclerosi è una malattia focale che si sviluppa preferenzialmente ai siti di disturbo del flusso nelle arterie, implicando eterogeneità spaziale in funzione endoteliale. ⁸ 9, 10, TNF-α induce una risposta ben caratterizzato in CE che include up-regolazione di molecole di adesione cellulare (CAM : ad esempio, VCAM-1, ICAM-1, E-selectina) e chemochine che reclutano monociti dal circolo, un segno distintivo della lesione aterosclerotica primi ¹¹ emodinamica è un importante regolatore del fenotipo endoteliale infiammatoria ¹² Alta tensione di taglio (HSS. magnitudo.; ad esempio 15 dyne / cm ²⁾ o sollecitazione di taglio pulsatile (PSS, ad esempio 15 ± 5 dyne / cm ²⁾ associati a siti di resistenza a aterosclerosi in arterie down-regolano TNF-α-risposte indotte. Al contrario, lo stress shear a bassa magnitudo (LSS: ad esempio, 2 dyne / cm ²⁾ o di taglio oscillatoria (OSS, ad esempio 0 ± 5 dyne / cm ^2), caratteristiche dei siti sensibili in vivo, esacerbare cytokine-indotta infiammazione. ^{13, 14} I nostri dispositivi microfluidici PDMS fornire una piattaforma per la realizzazione di studi meccanicistici per verificare ipotesi relative alla sovrapposizione di stress metabolico con i fattori idrodinamici nella regolazione della funzione endoteliale e la patologia. L'utilità e la versatilità del metodo è ampiamente illustrata attraverso i seguenti risultati rappresentativi.

Figura 1. Shear stress modula differenziale THP-1 di adesione delle cellule al TNF-alfa monostrati infiammate endoteliali. Questi dati sono stati acquisiti utilizzando il protocollo dettagliato descritto in precedenza e documentato nel video. Monostrati HAEC sono stati esposti contemporaneamente a una bassa dose di citochina infiammatoria TNF-α (0,5 ng / ml, ~ EC ₅₀ per VCAM-1 up-regulation) e sia HSS (15 dyne / cm ²⁾ o OSS (0 ± 5 dynes / cm ^2, 1 Hz) in un CSD personalizzato per 4 ore come descriletto nel protocollo dettagliato. THP-1 arresto cellulare è stata quantificata sotto flusso di taglio in una camera di flusso PDMS. Questa linea cellulare che imita il fenotipo di monociti umani è stato scelto per la sua riproducibilità e facilità d'uso. HSS attenuato la risposta infiammatoria rispetto agli OSS, con conseguente diminuzione THP-1 arresto cellulare. I dati sono stati analizzati mediante Student t-test e sono rappresentati come media ± SEM di 3 esperimenti indipendenti. Adattato con il permesso di DeVerse et al. ⁵

I dati che seguono dimostrano la versatilità del nostro approccio con esempi dal nostro lavoro pubblicato. Partenze dal protocollo di cui sopra sono indicati, se del caso.

Figura 2. Modulazione di citochine indotta VCAM-1 e reclutamento dei monociti in un gradiente di sollecitazione di taglio. A) HAEC monostrati sono state stimolate con TNF-α (0,3 ng / ml) per 4 ore sotto flow in uno VMMC progettato sulla base Hele-Shaw teoria del flusso. ¹⁵ A decremento lineare in grandezza SS lungo l'asse del canale è stato ottenuto progettando le pareti laterali della camera di coincidere con la ottimizza di un flusso due stagnazione dimensionali e di forma alla fine del canale per abbinare i iso-potenziali linee. La sollecitazione di taglio parete (τ _w) generata lungo la mezzeria di questo canale ad una distanza assiale dall'ingresso (x) è dato da:

dove μ è la viscosità del mezzo, Q è la portata volumetrica, h è l'altezza del canale, w ₁ è la larghezza del canale di ingresso, ed L è la lunghezza totale del canale. Q è stato scelto per generare un gradiente di grandezza da 16 SS dyne / cm ² a monte che a 0 al punto di stagnazione "a" appena prossimale al outlet. B)-C), VCAM-1 espressione è stata misurata in situ tramite microscopia immunofluorescenza usando anticorpi coniugati punti quantici e presentati come percentuale di intensità di fluorescenza media (MFI) di controllo non stimolato statico. SS non modulare il livello basale di VCAM-1, che è basso in HAEC non stimolate (triangoli grigi). Tuttavia, espressione di VCAM-1 è aumentato rispetto al TNF-α a grandezze LSS, con un picco a ~ 2 dyne / cm ² e tornare al TNF-α basale o inferiore a grandezze di taglio di 5 dyne / cm ² (quadrati neri). D) monociti (10 ⁶ / ml) sono stati perfusi a 2 dyne / cm ² per 5 min in canali di flusso paralleli su monostrati precondizionati come in A). Reclutamento dei monociti all'endotelio quantitativamente correlato con l'espressione di VCAM-1 in un ampiezza di taglio dato stress. In particolare, la capacità di sondare espressione di VCAM-1 e il reclutamento dei monociti con fine risoluzione spaziale in un monolayer rivelato cambiamenti significativi su un range limitato in grandezza SS che non dovrebbe essere apprezzato dagli applicando valori discreti poche di taglio in esperimenti separati. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA misure ripetute e valutate differenze di Newman-Keuls posttest, * P <0,05 da TNF-α in condizioni statiche. I dati sono media ± SEM di 3-6 esperimenti indipendenti. Adattato con il permesso di Tsou et al. ²

Figura 3. Lipoproteine ​​ricche di trigliceridi (TGRL) modulare citochine indotta infiammazione in proporzione a livelli di trigliceridi di siero e VCAM-1 espressione. HAEC monostrati sono state stimolate con TNF-α (0,3 ng / ml) per 4 ore simultaneamente con TGRL (10 mg / dl ApoB) isolato da soggetti umani dopo un pasto ricco di grassi nella cultura statica. A) espressione di VCAM-1 è stato misurato separatamente in sospeso CE mediante citometria a flussoe adesione monociti quantificato utilizzando un VMMC come descritto nel protocollo dettagliato. I dati sono presentati come variazione% di TNF-α. Arresto Monocyte varia in proporzione diretta alla endoteliale espressione di VCAM-1, che ha aumentato direttamente con il livello di trigliceridi di siero. B) Monocyte arresto per un sottoinsieme di pro-infiammatorie donatori è abrogata in presenza di un anticorpo VCAM-1 blocco. La significatività è stata determinata la Student t-test accoppiato, significa ± SEM di 3-5 esperimenti indipendenti. Adattato con il permesso di Wang et al. ⁴

Discussione

Si descrivono l'uso di dispositivi microfluidici PDMS per la valutazione on-chip di endoteliale fenotipo infiammatoria attraverso l'imaging in tempo reale di espressione CAM e adesione monociti. Uno dei principali vantaggi del nostro approccio risiede nella capacità di quantificare i risultati associati a disfunzione endoteliale in cellule esposte a mediatori infiammatori come i lipidi alimentari e citochine in condizioni idrodinamiche definiti che rispecchiano shear stress nei vasi aterogene. Il VMMC facilitare l'uso d...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Voce	Azienda	Numero di catalogo
100 x 20mm piastre di Petri	BD Falcon	353003
Etanolo 95%	EMD Chemicals	EX0290-1
DPBS	Cellgro	21-031-CV
Collagene di tipo I Tail derivata Rat	Gibco	A10483-01
Cellule endoteliali umane aortica	Genlantis	PH30405A
Antibiotico-antimicotica Solution	Invitrogen	15240-062
BulletKit endoteliale	Lonza	CC-4176
Endoteliali basali Media-2	Lonza	CC-3156
Siringhe da 10 ml	BD Falcon	309604
Tubi in poliuretano	Tygon	ABW0001
Leibovitz-15 supporti	Gibco	11415-069
Sylgard 184 Base in silicone elastomero	Dow Corning	184
Sylgard 184 elastomero siliconico Catalizzatore	Dow Corning	184
SU8 Photoresist Maestro Wafer	UC Davis Pan Lab	N / A
Eclipse TE200 microscopio invertito	Nikon	Eclipse TE200
Pompa a siringa	Harvard Apparatus	PHD2000
19 gauge ago ipodermico	Kendall	8881
THP-1 linea cellulare monocitica	ATCC	TIB-202
HBSS (Hanks soluzione salina tamponata) con Ca 2 + / Mg 2 +	Gibco	14025-092
Fattore di Necrosi Tumorale alfa (TNF-α)	R & D Systems	210-TA-010
Stromal Factor Derivato - 1 (SDF-1)	R & D Systems	350-NS-010
RPMI 1640	Cellgro	10-040-CV
Albumina serica umana (HSA)	ZLB Behring	NDC 0053-7680-32