Articolo metodologico

Un Toolkit per permettere la conversione di idrocarburi in ambienti acquosi

DOI:

10.3791/4182

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2 ottobre 2012

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1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

In questo articolo

Sommario

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Un sistema di regolazione automatica sostenibile batterica per la bonifica di inquinamenti del petrolio è stato progettato utilizzando le normali parti di DNA intercambiabili (BioBricks). L'ingegneria E. coli è stato usato per degradare alcani tramite β-ossidazione tossici in ambienti acquosi. Gli enzimi rispettivi di specie diverse hanno mostrato un'attività alcano degrado. Inoltre, una maggiore tolleranza N-Esano è stato ottenuto con l'introduzione di geni di alcano-tolleranti batteri.

Abstract

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Questo lavoro propone una serie di strumenti che consente la conversione di alcani da Escherichia coli e presenta una prova di principio della sua applicabilità. Il toolkit è costituito da più parti standard intercambiabili (BioBricks) 9 riguardanti la conversione di alcani, regolazione dell'espressione genica e della sopravvivenza in idrocarburi tossici ambienti ricchi.

A tre fasi pathway per la degradazione alcano è stato attuato in E. coli per consentire la conversione di alcani media e lunga catena ai loro rispettivi alcanoli, alkanals e infine alcanoico-acidi. Questi ultimi sono stati metabolizzati tramite il nativo di β-ossidazione percorso. Per facilitare l'ossidazione di alcani a catena media (C5-C13) e cicloalcani (C5-C8), quattro geni (alkB2, rubA3, rubA4 e Rubb) del sistema idrossilasi alcano da Gordonia sp. TF6 8,21 sono stati trasformati in E. coli. Per la conversione dialcani a catena lunga (C15-C36), il gene Lada da thermodenitrificans Geobacillus è stato attuato. Per i passaggi necessari ulteriori del processo di degradazione, ADH e ALDH (provenienti da thermodenitrificans G.) sono stati introdotti 10,11. L'attività è stata misurata mediante saggi su cellule quiescenti. Per ogni passaggio ossidativo, l'attività enzimatica è stata osservata.

Per ottimizzare l'efficienza del processo, l'espressione è indotta soltanto in condizioni di glucosio basso: un substrato regolato promotore, pCaiF, è stato utilizzato. pCaiF è presente in E. coli K12 e regola l'espressione dei geni coinvolti nella degradazione del glucosio non fonti di carbonio.

L'ultima parte del toolkit - mira sopravvivenza - è stato implementato utilizzando geni di tolleranza solventi, PhPFDα e β, sia dal Pyrococcus horikoshii OT3. Solventi organici possono indurre stress cellulare e diminuiscono la capacità di sopravvivenza di negativo affecting ripiegamento delle proteine. Come accompagnatori, PhPFDα e β migliorare il ripiegamento ad esempio processi di proteina in presenza di alcani. L'espressione di questi geni ha portato ad un miglioramento della tolleranza idrocarburo mostrato da una crescita maggiore (fino al 50%) in presenze del 10% di n-esano in mezzo di coltura sono stati osservati.

Riassumendo, i risultati indicano che il toolkit consente di E. coli da convertire e tollerare idrocarburi in ambienti acquosi. In quanto tale, rappresenta un primo passo verso una soluzione sostenibile per l'olio-bonifica utilizzando un approccio biologia sintetica.

Introduzione

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L'inquinamento da petrolio è tra le cause più gravi di contaminazione ambientale e colpisce notevolmente gli ecosistemi, le imprese e le comunità 3. Ad esempio, sono necessarie soluzioni per combattere il continuo inquinamento da petrolio originato dalle acque di decantazione delle sabbie bituminose in Alberta, in Canada. Durante il processo di estrazione del petrolio dalle sabbie bituminose, il bitume, una forma ossidata semisolida di petrolio, viene rimosso utilizzando tecniche di recupero termico che consumano circa 3,1 barili di acqua per singolo barile di petrolio 1. L'acqua di processo contaminata dal petrolio, proveniente principalmente da....

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Protocollo

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1. BioBrick Assemblea

  1. BioBricks della cancelleria di parti standard biologici sono forniti dalla sede centrale iGEM. Per costruire un nuovo BioBrick BioBricks esistenti, digerire il donatore BioBrick (fino a 1,0 mg) con gli enzimi EcoRI e SpeI di posizionamento dei donatori valle parte della parte accettore. Digerire con XbaI e PstI per posizionare la parte donatore monte della parte accettore. Aggiungi un enzima di restrizione terzo opportuno che interviene la spina dorsale del donatore. Eseguire le digestioni in un volume totale di 20-25 ml con il tampone appropriato, secondo il fornitore (concentrazione finale 1x). Utilizzare 5 unità / mg di DNA per gli....

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Risultati

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Alcani

L'attività delle tre fasi di ossidazione dall'alcano al rispettivo acido grasso è stata valutata utilizzando saggi su cellule a riposo e misurazioni dell'attività enzimatica. I risultati sono presentati seguendo le reazioni di via (1) alcanoidrossilasi, (2) alcol deidrogenasi e (3) aldeide deidrogenasi.
Per la prima fase, sono stati costruiti diversi plasmidi per alcani a catena media e lunga. Il plasmide .......

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Discussione

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Il principio BioBrick viene utilizzato per costruire un telaio per la degradazione di alcani e una prova di principio per i singoli componenti del toolkit è stato ottenuto. Parecchi saggi sono proposto di misurare in vivo e in vitro di alcano pathway enzimi degradativi. Il lavoro presentato dimostra con successo un certo numero di metodi che possono essere utilizzati per determinare le attività enzimatiche e espressione nell'ospite microrganismo E. coli dopo l'implementazione di BioBri.......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Gli esperimenti condotti in questo video-articolo sono stati sviluppati per il concorso internazionale macchina Genetically Engineered 9. Gli autori desiderano ringraziare i membri del team iGEM Luca Bergwerff, Pieter van TM Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Cueto Rojas e Ramon van der Valk per l'assistenza nella ricerca. Ringraziamo Han de Winde, Stefan de Kok e Esengül Yıldırım per le discussioni utili e che ospitano questa ricerca. Questo lavoro è stato sostenuto dal TU Delft University Dipartimento di Biotecnologie, Il laboratorio di Bioinformatica Delft, TU Delft Dipartimento di Bionanoscience, Oil Sands Leadership Initiative (OSLI), Stud studente....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
E. coli K12New England BiolabsC2523H
OctaneFluka74822
EsadecanoFluka52209
ottanolo-1Fluka95446
dodecanolo-1Sigma-Aldrich126799
EsanoSigma-Aldrich296090
NADHSigma-AldrichN4505
FMNSigma-AldrichF2253
MgSO4J.T. Baker Casno7487 889
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
T4 ligasiNew England BiolabsM0202L
Gascromatografo
Disgregatore cellulareLA BiosystemsCD-019
SpettrofotometroAmersham pharmaciaspec 2000
Lettore di piastreTecan Group Ltd.Magellan v7.0
Incubator Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubBDelft University of Technology presso il dipartimento di Biotecnologie o Registro delle PartiBiologiche StandardBBa_K398014Sistema di idrossilasi alcano
Resistenza: Cloramfenicolo
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA Università di Tecnologia di Delft presso il dipartimento di Biotecnologie o Registro delle PartiBiologiche StandardBBa_K398027ladA Generatore di proteine
Resistenza: Cloramfenicolo
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH Università di Tecnologia di Delft presso il dipartimento di Biotecnologie o Registro delle PartiBiologiche StandardBBa_K398018ADH generator
Resistenza: Cloramfenicolo
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH Delft University of Technology presso il dipartimento di Biotecnologie o Registro delle PartiBiologiche StandardBBa_K398030ALDH generator
Resistenza: Cloramfenicolo
BioBrickTM K398326: pCaiF Delft University of Technology presso il dipartimento di Biotecnologie o Registro delle Parti Biologiche StandardBBa_K398326pCaiF promoter
Resistenza: Cloramfenicolo
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401Delft University of Technology presso il dipartimento di Biotecnologia o Registro delle Parti Biologiche StandardBBa_K398331pCaiF dispositivo di misurazione
Resistenza: Cloramfenicolo
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα -BBa_J61107- Università di Tecnologia di Delft presso il dipartimento di Biotecnologia o Registro delle Parti Biologiche StandardBBa_K398406Cluster di tolleranza al solvente
Resistenza: Cloramfenicolo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
  2. Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological C....

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Degradazione degli alcaniEscherichia colisistema BioBricksregolazione dell espressione genicatolleranza ai solventisaggi con cellule a riposopromotore regolato dal substratotolleranza agli idrocarburibiologia sintetica

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