Purificazione e aggregazione della proteina precursore dell'amiloide dominio intracellulare

Sommario

Un metodo per la grande purificazione del dominio intracellulare APP (AICD) è descritto. Abbiamo anche descrivere la metodologia di indurre In vitro AICD aggregazione e visualizzazione mediante microscopia a forza atomica. I metodi descritti sono utili per la caratterizzazione biochimica / strutturale del AICD e gli effetti di chaperone molecolare sulla sua aggregazione.

Abstract

Proteina precursore dell'amiloide (APP) è un tipo di proteina transmembrana I associato alla patogenesi della malattia di Alzheimer (AD). APP è caratterizzata da un grande dominio extracellulare e un dominio breve citosolico chiamato il dominio intracellulare di APP (AICD). Durante la maturazione attraverso la via secretoria, APP può essere scissa dalla proteasi denominate α, β, e γ-secretasi ^1. Sequenziale clivaggio proteolitico di APP con β e γ-secretasi porta alla produzione di un peptide piccolo proteolitico, Ap definito, che è amiloidogena e il componente principale delle placche senili. L'AICD è liberata dalla membrana dopo trasformazione secretasi, e attraverso interazioni con Fe65 e Tip60, può traslocare al nucleo di partecipare nella regolazione della trascrizione di geni bersaglio più ^2,3. Proteina-proteina interazioni che coinvolgono il AICD può influenzare il traffico, l'elaborazione, e le funzioni cellulari di olo-APP e il suo C-terminaL frammenti. Abbiamo recentemente dimostrato che AICD può aggregare in vitro, e questo processo è inibito dalla AD-implicato chaperone molecolare ubiquilin-1 ^4. Coerentemente con questi risultati, il AICD ha esposto domini idrofobici ed è intrinsecamente disordinati in vitro ^5,6, tuttavia ottiene stabile struttura secondaria quando si lega al Fe65 ^7. Abbiamo proposto che ubiquilin-1 impedisce appropriato interazioni inter e intramolecolari di AICD, impedendo l'aggregazione in vitro e in cellule intatte ^4. Mentre la maggior parte degli studi si concentrano sul ruolo di APP nella patogenesi di AD, il ruolo di AICD in questo processo non è chiara. Espressione di AICD ha mostrato di indurre apoptosi ^8, per modulare i percorsi di segnalazione ⁹ e di regolare il calcio segnalazione ^10. Over-espressione di AICD e Fe65 in un modello di topo transgenico induce Alzheimer come patologia ^11, e recentemente AICD è stato rilevato in reggisenonei lisati mediante Western blotting utilizzando appropriate tecniche di recupero di antigene ^12. Per facilitare studi strutturali, biochimici e biofisici del AICD, abbiamo sviluppato una procedura per produrre quantità elevate di ricombinante altamente puro proteine ​​AICD. Abbiamo inoltre descrivere un metodo per indurre l'aggregazione in vitro termica AICD e analisi mediante microscopia a forza atomica. I metodi descritti sono utili per la caratterizzazione biochimica, biofisica e strutturale del AICD e gli effetti di chaperone molecolare sull'aggregazione AICD.

Protocollo

1. L'espressione di APP ricombinante dominio intracellulare (AICD)

1. Transform E. coli ceppo BL21 con AICD umana (residui 649-695 di APP, isoforma neuronale numerazione) clonato nel vettore pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Questo vettore esprimerà AICD la porzione C-terminale di una proteina di fusione di glutatione-S-transferasi (GST). Questo vettore codifica anche una sequenza trombina clivaggio per facilitare la rimozione della porzione GST. Dettagli della clonazione AICD in pGEX-4T-1 può essere trovata nella nostra precedente pubblicazione ^4.
2. Da una singola colonia, inoculare 10 ml di brodo LB con ampicillina (100 ug / ml), e incubare una notte a 37 ° C con agitazione vigorosa.
3. Il mattino seguente, inoculare 400 ml LB / ampicillina in una beuta da un litro con 5 ml di coltura durante la notte.
4. Incubare a 37 ° C con agitazione vigorosa fino a quando la densità ottica a 600 nm ha raggiunto 0,4-0,6. Questo normalmente 2-2,5 ore.

contenuto "> A questo punto può essere desiderabile per prendere un piccolo campione (~ 10 pl) di seguire la purificazione mediante SDS-PAGE (Figura 1A, B). Ogni fase successiva purificazione deve anche avere una piccola aliquota rimossi per l'analisi mediante SDS-PAGE.

5. Indurre l'espressione di GST-AICD aggiungendo 0,4 mM di isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG). Incubare a 37 ° C con agitazione vigorosa per 5 ore.
6. Centrifugare le cellule a 6.000 xg per 15 min a 4 ° C. Il pellet cellulare può essere conservato a -80 ° C per diversi mesi, a questo punto del procedimento.

2. Purificazione di GST-AICD

1. Preparare 50 ml di tampone di lisi come segue: 1 mM ditiotreitolo 1 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF), Complete cocktail inibitore di proteasi (Roche Applied Science), e tampone fosfato. Freddo sul ghiaccio.
2. Scongelare pellet batterico (se precedentemente congelato) sullaghiaccio.

A questo punto, è fondamentale che tutti i passi vengono eseguiti a 4 ° C per limitare proteolisi. Tutti i tubi, tamponi, e altri reagenti devono essere pre-refrigerati. Se si utilizza una pressa francese o emulsionante per lisi, questi dovrebbero essere pre-refrigerati pure.

3. Accuratamente risospendere il pellet batterico in 20 ml di tampone di lisi. Una combinazione di vortex e triturazione con pipetta 10 ml di ghiaccio assicurerà completa risospensione del pellet.
4. Far passare le cellule risospese batteriche attraverso un emulsionante (ad esempio, Avestin Emulsiflex-C3) o cellule pressione francese, pre-refrigerati a 4 ° C a 30.000 psi. Passare il lisato attraverso l'emulsionante una seconda volta. Raccogliere il lisato in un pre-refrigerati tubo da 50 ml.

Il vantaggio principale di questi due strumenti è che minimizzare il riscaldamento del campione. La tecnica comunemente usata di sonicazione genera calore sulla punta della sonda sonicazione epuò causare aggregazione di proteine ​​ricombinanti.

5. Centrifugare il lisato a 15.000 xg per 30 min. Separare e mantenere il supernatante in un pre-raffreddata tubo da 50 ml.
6. Aggiungere 500 pl di un impasto al 50% di glutatione-agarosio (Sigma-Aldrich). Ruotare per 30 min a 4 ° C. Mentre il campione sta ruotando, fanno tampone fresco eluizione: 50 mM Tris 7,8, 0,1% Triton-X100, 0,5 mM di ditiotreitolo, 10 mM glutatione ridotto.

L'unico passo del protocollo che viene eseguita a temperatura ambiente è la fase di eluizione. Così, il tampone di eluizione viene mantenuta a temperatura ambiente. Buffer di eluizione deve essere preparato fresco.

7. Versare il lisato e dei liquami in un usa e getta 5 "colonna polistirolo cromatografia con grossolani (90-130 micron) filtri (Evergreen scientifico). Lavare la colonna 5 volte con 3 ml di tampone fosfato.
8. Tappare il fondo della colonna e aggiungere 500 microlitri di tampone di eluizione temperatura ambiente. Cap all'inizio dellacolonna e ruotare per 5 min a temperatura ambiente. Raccogliere l'eluato in una provetta da microcentrifuga refrigerata 1,5 ml. Ripetere l'eluizione altre due volte (1.5 ml eluato totale).
9. Dializzare l'eluato in un molecolare 10000 membrana di dialisi taglio di peso (ad esempio, Thermo Scientific Slide-A-lizzatore dialisi cassette) in 4 litri di soluzione salina tamponata per una notte a 4 ° C. Dializza contro un ulteriore 4 litri di tampone fosfato a 4 ° C per 1 ora il giorno seguente.
10. Rimuovere la proteina dalla cassetta dialisi ed eseguire un test per determinare la quantificazione delle proteine ​​resa di GST-AICD. Una purificazione tipico da 400 ml di coltura comporta rendimenti di> 20 mg di proteina purificata a concentrazioni di 10-20 mg / ml. Aliquotare la proteina in 200 pl aliquote e congelati a -80 ° C.

3. Cleavage trombina di GST-AICD e Purificazione di AICD

1. Scongelare 200 ml di acqua di GST-AICD e aggiungere 20 ml di 1 U / mL thrombtrovi Incubare per una notte a 37 ° C.

La qualità e la purezza della trombina varia considerevolmente tra i costruttori, e può essere una fonte di contaminazione. Usiamo trombina da GE Healthcare (vedi tabella dei reagenti). Dopo incubazione per una notte,> 95% della proteina di fusione deve essere scisso (Figura 1B).

2. Dopo clivaggio notte con trombina, è probabile che una frazione del AICD liberato subito aggregazione e la soluzione può apparire torbida. Cancellare il materiale aggregato mediante centrifugazione a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante in un pre-raffreddata provetta per microcentrifuga.
3. Aggiungere 50 ml di 50% di glutatione-agarosio slurry e 50 pl 50% p-aminobenzamidine-agarosio slurry per rimuovere GST e trombina, rispettivamente. Incubare con rotazione per 5 min a temperatura ambiente.
4. Centrifugare brevemente per sedimentare le perline di agarosio, e rimuovere il surnatante in una nuova provetta. Estratto tGST ha quattro volte più con glutatione-agarosio. Una singola estrazione con p-aminobenzamidine-agarosio è sufficiente a rimuovere il 20 U di trombina.
5. Eseguire un test di quantificazione delle proteine, il 5 microlitri della AICD purificato. Rese tipiche di una cultura 400 ml sono 50-100 mcg ad una concentrazione di 0,2 a 0,5 mg / ml. Rese più elevate sono possibili, con l'adesione più grandi volumi di GST-AICD.

Purificato AICD deve essere preparato fresco per la caratterizzazione biochimica / biofisica. Materiale non utilizzato deve essere eliminato. È anche possibile concentrare il AICD dalla liofilizzazione del campione e la risospensione in un volume più piccolo di tampone ^6. Se la rilevazione AICD richiede assorbente (ad esempio dopo una trappola filtro o saggio dot blot), il recupero antigene sulla membrana deve essere eseguita come descritto da Pimplikar e Suryanarayana ^12.

4. Aggregazione AICD per microscopia a forza atomica (AFM)

1. Diluire appena preparata AICD in phosphate salina tamponata ad una concentrazione di 0,1 mg / ml in un volume finale di 15 microlitri. A questo punto, vari composti e / o le proteine ​​possono essere aggiunti per determinare se essi inibiscono l'aggregazione AICD. Per esempio, abbiamo dimostrato che le concentrazioni equimolari di ubiquilin-1 prevenire l'aggregazione di AICD in questo test ^4.

È anche possibile aggregare grandi volumi di reazione per esperimenti biochimici come saggi trap filtrazione e diffusione della luce ^4. Abbiamo avuto successo eseguendo saggi trappola filtro su miscele di reazione più grande a 400 ml con AICD diluito a concentrazioni a partire da 1 pM.

2. Inducono aggregazione termica incubando i campioni a 43 ° C con agitazione a 800 rpm in un Thermomixer Eppendorf per 48 ore. Questa temperatura è stato scelto sulla base di test di chaperone che esaminano l'aggregazione termica del modello citrato sintasi accompagnatore substrato ^4,13.

3. Diluire il campione di 20 volte in acqua deionizzata e posto su 2 microlitri mica appena spaccati. Essiccare il campione in essiccatore notte. Sarà necessario determinare empiricamente la diluizione ottimale per immagini, e quindi diluizioni diverse da 10 - a 100 volte sarebbe prudente.
4. Visualizza la AICD aggregato AFM utilizza il sistema operativo in tapping mode ^14. I cantilever utilizzati sono leve micro oro rivestite con nitruro di taglienti (MSNL, Bruker) con un raggio di punta nominale di 2 nm. Tipica toccando ampiezze duranteing imaging sono 10-20 nm alla frequenza di risonanza del cantilever (30-50 kHz).

Abbiamo trovato che la qualità dell'immagine e il contrasto di aggregati proteici differenti dipendeva dalla forza applicata e la durata dell'esperimento. Per minimizzare perturbazione campione dalla punta, abbiamo mantenuto la forza applicata relativamente basso mantenendo un set-point rapporto superiore al 95% e limitando la scansione di ogni campione per 5-10 min. L'elaborazione delle immagini è stata effettuata con il software WSxM (Nanotec). Elaborazione immagine standard consisteva piano sottrazione e appiattimento. I nostri laboratori utilizzano una "casa-costruita" AFM ¹⁵ interfacciato ad un sistema commerciale di sonda di controllo microscopio a scansione (Nanotec).

5. Risultati rappresentativi

L'espressione e arricchimento relativo di GST-AICD è mostrato nella Figura 1A. Dopo lisi, la maggior parte della proteina di fusione è presente nella frazione solubile e quindi estrazione da Inclusiil corpo non è necessaria. Il materiale eluito dalla colonna di glutatione agarosio è> 95% puro. Nella preparazione mostrato nella figura 1, la concentrazione di proteina eluita dalla colonna era 14,5 mg / ml, e la resa era 22 mg (da una coltura iniziale di 400 ml). Clivaggio di 200 pl di questa preparazione overnight con 20 U di trombina comportato quasi il 100% clivaggio della proteina di fusione (Figura 1B). La quantità di trombina utilizzata è sufficientemente basso da non essere rilevabile mediante colorazione con Coomassie blue (vedi corsia "Cleaved", Figura 1B). Rimozione della trombina e GST provocato una perdita di materiale, tuttavia era> 90% puro con una resa in questa preparazione di 70 pg di AICD ad una concentrazione di 0,35 mg / ml. Figura 1C mostra il diagramma di flusso per l'aggregazione di AICD e successiva analisi. Aggregati AICD ripreso da AFM sono tipicamente sferoide / amorfo, e la gamma nel formato da 50 a 100 nM (Figura 1D, F). Aggregatomateriale non è rilevabile quando una quantità equimolare di chaperone ubiquilin-1 viene aggiunto alla reazione di aggregazione (Figura 1E) ^4.

Figura 1. Purificazione e aggregazione di AICD. A) Coomassie colorazione blu di campioni raccolti in ogni fase del processo di purificazione. Per i campioni uninduced e indotta, 20 pl di batteri totali sono stati eseguiti sul gel. Per la frazione supernatante, 5 microlitri di lisato (da un volume totale di 20 ml) sono stati analizzati su gel. Per la frazione di pellet, il pellet è stato risospeso in 20 ml di tampone di lisi, e 5 microlitri di questo materiale sono stati sonicati in un sonicatore bagno di acqua per 30 minuti a 4 ° C prima di caricare il gel. Per l'eluato, 5 microlitri sono stati eseguiti sul gel. Le quantità di eluato caricati sul gel sono indicati. B) Coomassie blu gel colorato di uncleaved e spaccati GST-AICD (2 ml) e 1 e 5 & mu, l purificato AICD. C) Diagramma di flusso di purificazione AICD, aggregazione e analisi. D, E) Rappresentante AFM immagine termicamente aggregate AICD in assenza (D) e presenza (E) del chaperone molecolare ubiquilin-1. F) Istogramma della distribuzione delle dimensioni degli aggregati AICD.

Discussione

In questo protocollo abbiamo delineato una procedura per ottenere AICD elevata purezza per analisi strutturali, biofisica e biochimica. Questa procedura non richiede attrezzature sofisticate cromatografia ed è quindi accessibile alla maggior parte dei laboratori. Altri gruppi hanno purificato AICD ^5-7,16, compreso GST-AICD ^17-19, per le analisi biochimiche / strutturale. Svantaggi ai protocolli precedenti includono scarsa solubilità di AICD ^16, a meno di ideale purezza ^17, e l...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
Trombina	GE Healthcare	27-0846-01
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760
Bradford proteine ​​reagenti del dosaggio	Bio-Rad	500-0002
Coomassie blu	Bio-Rad	161-0786
IPTG (isopropil-beta-D tiogalattopiranoside)	Sigma-Aldrich	I6758
Glutatione-agarosio	Sigma-Aldrich	G4510
p-aminobenzamidine-agarosio	Sigma-Aldrich	A7155
Completa cocktail di inibitori delle proteasi	Roche	11836170001
Slide-A-lizzatore dialisi cassette	Thermo Scientific	66380
Cromatografia colonne	Evergreen scientifico	208-3367-050
Emulsionante	Avestin, Inc	Emulsiflex-C3	Consigliatissimo
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670107
Mica dischi	Ted Pella	50-12
Cantilever AFM	Bruker	MSNL-10
WSxM software	Nanotec	N / A	Pee scaricare