Un nuovo metodo di screening per l'Evoluzione diretta di enzimi termostabili bacteriolytic

Summary

Un nuovo metodo evoluzione diretta specifico campo dell'ingegneria termostabilità stato sviluppato e validato per conseguenza enzimi bacteriolytic. Dopo un solo ciclo di mutagenesi casuale, un enzima evoluta bacteriolytic, PlyC 29C3, visualizzato superiore a due volte l'attività residua rispetto alla proteina wild-type, dopo incubazione temperatura elevata.

Abstract

Evoluzione diretta è definito come un metodo per sfruttare selezione naturale per ingegnerizzare proteine ​​di acquisire proprietà particolari che non sono associati con la proteina in natura. La letteratura ha fornito numerosi esempi per quanto riguarda l'attuazione di evoluzione diretta a modificare con successo specificità molecolare e catalisi ^1. Il vantaggio principale di utilizzare evoluzione diretta anziché più razionale approcci per l'ingegneria molecolare riguarda il volume e la diversità delle varianti che possono essere proiettati ^2. Una possibile applicazione di evoluzione diretta consiste nel migliorare la stabilità strutturale di enzimi bacteriolytic, come endolysins. Batteriofago codificare ed esprimere endolysins di idrolizzare un legame covalente critica nel peptidoglicano (cioè della parete cellulare) di batteri, con conseguente lisi della cellula ospite e la liberazione dei virioni progenie. In particolare, questi enzimi hanno la capacità di indurre lisi estrinsecamente a susceptbatteri commestibili in assenza di fago ed inoltre sono stati convalidati in vitro e in vivo per il loro potenziale terapeutico ^3-5. L'oggetto del nostro studio coinvolge l'evoluzione diretta PlyC endolysin, che è costituito da subunità PlyCA e PlyCB ^6. Quando purificata e ha aggiunto estrinsecamente, il holoenzyme PlyC lisa streptococchi di gruppo A (GAS), così come altri gruppi di streptococchi in una manciata di secondi e, inoltre, è stato validato in vivo contro GAS ^7. Significativamente, il monitoraggio cinetica enzimatica residua dopo incubazione di temperatura elevata e di distinte prove che perde PlyC attività litica bruscamente a 45 ° C, suggerendo una vita breve terapeutico, che può limitare lo sviluppo ulteriore di questo enzima. Ulteriori studi rivelano la mancanza di stabilità termica è osservato solo per la subunità PlyCA, mentre la subunità PlyCB è stabile fino a ~ 90 ° C (osservazioni non pubblicate). Oltre a PlyC, ci sono several esempi in letteratura che descrivono la natura termolabile di endolysins. Per esempio, il endolysin LysK Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 e Pal perdere attività spontaneamente a 42 ° C, 43,5 ° C e 50,2 ° C, rispettivamente ^8-10. Secondo l'equazione di Arrhenius, che riguarda la velocità di una reazione chimica alla temperatura presente nel sistema particolare, un aumento termostabilità si correlano con un aumento della speranza shelf life ^11. A questo fine, evoluzione diretta ha dimostrato di essere un utile strumento per alterare l'attività termica di varie molecole in natura, ma non ha mai questa particolare tecnologia state sfruttate con successo per lo studio di enzimi bacteriolytic. Allo stesso modo, i conti di successo del processo di attuazione della stabilità strutturale di questa particolare classe di antimicrobici tutto sono inesistenti. In questo video, ci avvaliamo di una nuova metodologia che utilizza un errore-pruno polimerasi DNA seguita da un processo di screening ottimizzato utilizzando un formato a 96 pozzetti di micropiastre per identificare mutazioni della subunità PlyCA del endolysin PlyC streptococcica che correlano ad un aumento della stabilità cinetica enzimatica (Figura 1). I risultati dopo un solo giro di mutagenesi casuale suggerisce la metodologia sta generando varianti PlyC che conservano più di due volte l'attività residua rispetto al wild-type (WT) PlyC dopo il trattamento temperatura elevata.

Protocol

1. Determinare le condizioni di riscaldamento ottimale

Primo, si deve determinare sperimentalmente la temperatura ottimale di incubazione e tempo da utilizzare per la fase di riscaldamento nel saggio. Per il nostro modello PlyC, è importante notare che E. coli co-trasformate con geni plyCA e plyCB su plasmidi di espressione separati è stato mostrato per formare un holoenzyme completamente funzionale PlyC ^6. Il 96 ben preparato micropiastra nonché condizioni di crescita cellulare e la successiva tecnica replica plating sono state adattate da esempi forniti in letteratura ^12-16. Un tempo di incubazione di 30 minuti sarà adatto a questo test come risulta da precedenti esperimenti di inattivazione termica dettare una rapida perdita di attività durante il breve periodo di incubazione in ambienti superiori a temperatura fisiologica (osservazioni non pubblicate). La temperatura di incubazione ottimale per PlyC stata chiarita dai seguenti passi:

1. Transform l'espressione costrutto pBAD24: plyCA (Amp ^r) nel competente E. coli ceppo DH5a pBAD33: plyCB (Cm ^r).
2. Piastra trasformanti su un Luria-Bertani (LB) agar integrato con ampicillina (100 ug / ml) e cloramfenicolo (35 mg / ml). Incubare le piastre per una notte a 37 ° C.
3. Con uno stuzzicadenti sterile, inoculare una colonia individuo in ogni fila di pozzetti (Figura 2a) in un contenitore sterile, chiaro, a fondo piatto da 96 pozzetti, con coperchio micropiastra che contiene 200 ml di LB integrato con ampicillina e cloramfenicolo.
4. Fissare posizionare la piastra a 96 pozzetti microtitolo su un 37 ° C agitando incubatore e far crescere i batteri durante la notte a 300 giri al minuto.
5. Recuperare la piastra a 96 pozzetti microtitolo da 37 ° C agitando incubatore e piastra replica a un nuovo 96 micropiastra così come segue:
   1. Aggiungere 180 ml di LB integrato con ampicillina e cloramfenicoloa ciascun pozzetto della piastra di replica.
   2. Trasferire 20 microlitri di batteri dalla piastra originale rispettivi pozzetti nella piastra replica. Ciò dovrebbe tradursi in un iniziale OD ₆₀₀ di ~ 0.5.
6. Fissare la piastra replica sul 37 ° C agitando incubatore e incubare la piastra per 1 ora a 300 giri al minuto, quindi aggiungere il inductant. Nel caso dei sistemi di espressione pBAD, il inductant è 0,25% arabinosio. Altri sistemi di espressione possono richiedere inductants diverse. Posizionare la piastra posteriore sul 37 ° C agitando incubatore e agitare a 300 rpm per un ulteriore 4 ore per consentire l'espressione della proteina. I livelli di espressione in genere varia tra 10-20 mg di PlyC.
7. Una volta che l'espressione della proteina è giunta alla conclusione, recuperare la piastra di replica e pellet i batteri mettendo la piastra a 96 pozzetti microtitolo in una centrifuga refrigerata che contiene un oscillante-Rotore che si adatta alle piastre da 96 microtitolazione bene. Centrifugare a 3000 rpm per 10 min a temperatura ambiente.
8. Rimuovere il surnatante supporti lentamente invertendo la micropiastra e delicatamente decantazione dei media.
9. Lisare le cellule aggiungendo 50 pl di reagente B-PER proteina batterica estrazione II a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 min.
10. Aumentare il volume di ciascun pozzetto a 120 microlitri con l'aggiunta di 70 microlitri di tampone fosfato salino (PBS), pH 7,2.
11. Pellet i detriti cellulari insolubili facendo girare la piastra a 3000 rpm per 10 min a 4 ° C in centrifuga refrigerata.
12. Trasferire 110 microlitri del lisato grezzo solubile ai corrispondenti pozzetti di una piastra a 96 termociclatore bene.
13. 30 min usando il tempo di incubazione predeterminato, esporre i lisati solubili che risiedono nel pozzo 96 piastra termociclatore a un'ampia gamma gradiente di temperatura 15-20 ° C. spanning Si noti, l'obiettivo è quello di determinare a quale temperatura un particolare enzima perde> l'attività catalitica del 95%.
14. Dopo l'incubazione, incubare il 96 pozzettiPiastra termociclatore a 4 ° C per 5 minuti e trasferire 100 ul dei lisati solubili dalla piastra 96 ​​termociclatore bene alla loro posizione corrispondente nella finale micropiastra da 96 pozzetti.
15. Con un 12 canali multipipettor, aggiungere 100 microlitri di ceppo GAS D471 a ciascun pozzetto. Nota, D471 cellule sono originariamente liofilizzato da culture durante la notte e risospese con PBS pH 7.2 per ottenere un OD ₆₀₀ di ~ 2.0.
16. Porre immediatamente la piastra a 96 pozzetti nello spettrofotometro per micropiastre e monitorare le cinetiche enzimatiche misurando la OD ₆₀₀ ogni 15 sec per 20 min. L'incubazione temperatura più bassa che corrispondeva a pozzetti che non avevano una variazione della densità ottica (AOD ≤ 0,1) è definita come la temperatura non permissive.

Dopo una schermata di temperatura ampio viene eseguita per identificare la temperatura non permissive, i passi di cui sopra possono essere ripetute in un intervallo più stretto di temperature (5 ° -10 ° C) per chiarirel'esatta temperatura non permissive per l'enzima di interesse. Nota, la temperatura non permissive identificati in questo saggio può essere diverso rispetto alla temperatura di fusione chiarita con altri mezzi causa di differenze di volume, concentrazione, ecc

2. Generare la Biblioteca Mutant

La creazione della libreria mutante da vagliare comporta casualmente incorporando le mutazioni da un soggetto a errori DNA polimerasi con una minima distorsione nucleotide nel gene plyCA utilizzando il kit di mutagenesi casuale GeneMorph II come segue:

1. Progettare inneschi nucleotidiche con temperature di fusione simili (T _m) tra 55-72 ° C con i siti di restrizione di scelta al 5 'e 3' del gene plyCA.
2. Dal momento che il tasso di mutazione desiderata è di 2-3 nucleotidi per plyCA (1,4 kb), utilizzare le concentrazioni dei componenti di reazione PCR e le condizioni termociclatore raccomandati dal produttore per f mutazione bassorequencies (0-4,5 per kb).
3. Clonare i geni mutagenizzate plyCA nel vettore di espressione pBAD24.
4. Trasformare i costrutti in un DH5a pBAD33: sfondo plyCB e trasformanti piastra su piastre di LB agar addizionato con ampicillina e cloramfenicolo.
5. Inoltre, la trasformazione e la piastra DH5a pBAD33: plyCB con il vettore di espressione contenente il gene pBAD24 WT plyCA. Le colonie di questa piastra serviranno da controlli durante lo screening.

3. 96 pozzetti Micropiastra Preparazione e condizioni di crescita delle cellule

1. Riempire ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetto di microtitolazione con 200 pl di LB supplementato con ampicillina e cloramfenicolo.
2. Seguendo lo schema micropiastra (Figura 2b), selezionare con attenzione una colonia individuo dalle piastre di agar durante la notte con uno stuzzicadenti sterilizzato e inoculare i batteri nel pozzetto designato del 96 pozzetti microtitolo plate. È essenziale garantire una sola colonia per pozzetto viene inoculato.
3. Agitare il saldamente ancorato microtitolo da 96 pozzetti a 300 rpm notte a 37 ° C.

4. Replica Placcatura, Espressione induzione delle proteine ​​e Preparazione del lisato

1. Seguire i passaggi 1,5-1,11 nella sezione intitolata "Determinazione delle condizioni ottimali di riscaldamento" con una modifica. Conservare la piastra originale a 4 ° C dopo la fase di replicazione delle piastre ha concluso.
2. Dopo passo 1,11, trasferimento 110 microlitri del lisato grezzo solubile ai corrispondenti pozzetti di una piastra a 96 termociclatore bene tranne per il controllo positivo pozzetti A1-D1. Per quanto riguarda i lisati di controllo positivo (lisati cioè non riscaldati), 100 pl trasferimento dei lisati ai corrispondenti pozzetti in una nuova 96 micropiastra bene che servirà come piastra di saggio finale per l'esperimento e memorizzare su ghiaccio.

5. Solubile Trattamento Termico del lisato

1. Riscaldare il controllo negativo e solubile mutante lisati attualmente confinato nella piastra 96 ​​termociclatore bene nel termociclatore per 30 min al ottimizzato non permissivo temperatura di incubazione determinata nel passaggio 1.
2. Dopo non permissivo temperatura di incubazione, incubare la piastra a 96 pozzetti termociclatore a 4 ° C per 5 min.
3. Trasferire 100 ul dei lisati solubili dalla piastra 96 ​​termociclatore pure alle loro posizioni identiche nella finale 96 pozzetti microtitolo saggio già contenente i lisati controllo positivo solubili.
4. Con un 12 canali multipipettor, aggiungere 100 microlitri di ceppo GAS D471 a ciascun pozzetto. Porre immediatamente la piastra nello spettrofotometro per micropiastre.
5. Monitorare le cinetiche enzimatiche misurando la OD ₆₀₀ ogni 15 sec per 20 min.
   1. Una variante PlyC con progredito comportamento termico è definito come un costrutto che può diminuire la densità ottica originale del 50 percento in meno di 900 secondi alnon permissivo temperatura. Inoltre, i controlli positivi (cioè non riscaldata, WT PlyC) necessario visualizzare WT attività catalitica (t _1/2 ≤ 100 sec) e controlli negativi (ossia riscaldata, WT PlyC) dovrebbe essere privo di attività.
6. Una volta che una variante PlyC con progredito comportamento termico è identificato, recuperare la piastra originale conservato a 4 ° C e batteri inoculare dall'individuo ben specifica al mutante di interesse in mezzi freschi LB addizionato con ampicillina e cloramfenicolo. Crescere l'inoculo notte a 37 ° C.
7. Estrarre e purificare il DNA plasmidico dalla cultura e quindi inviare per il sequenziamento al fine di individuare le mutazioni nucleotidiche che dedurre una migliore comportamento termico a PlyCA. Inoltre, integrare una piccola aliquota della coltura durante la notte con 10% glicerolo e conservare a -80 ° C per un ulteriore uso.

Results

Al termine del primo turno di mutagenesi casuale, oltre 6.000 PlyC mutanti sono stati selezionati e un totale di 35 mutanti con potenziale aumentato comportamento termico sono stati individuati, selezionati e sequenziati. Analisi genomica, riassunti nella Tabella I, suggerisce che dei 35 candidati, 7 dei costrutti WT sequenze contenute PlyCA a livello della traduzione, corrispondente a falsi positivi identificati dal test. Dei rimanenti 28 candidati, la gamma mutazione era 1-6 mutazioni nucleotidiche con un tasso di mutazione medio di 2,75 nucleotidi per plyCA gene, che si trovava nel campo di 2-3 mutazione nucleotidica eravamo targeting. A livello traduzionale, questa particolare mutazione nucleotidica e frequenza ha prodotto un amino acido gamma mutazione di 1 a 5 amminoacidi, con un tasso di mutazione media di 1,9 mutazioni aminoacidiche per PlyCA polipeptide.

Dei 28 candidati con almeno un amminoacido Mutatione, quattro di questi costrutti mutanti sono stati scelti casualmente per l'ulteriore caratterizzazione per verificare che il processo di screening estensivo della metodologia evoluzione diretta era effettivamente funziona correttamente. Gli enzimi mutanti PlyC state purificate ad omogeneità> 95% sulla base delle analisi SDS-PAGE come precedentemente descritto ^6-7. Cinetica enzimatica di WT PlyC e ciascuno dei quattro mutanti PlyC stati caratterizzati pari a concentrazioni molari dopo incubazione enzimi purificati a varie temperature elevate. Attività è stato monitorato dopo aggiunta di D471 GAS misurando la densità ottica a 600 ogni 15 nm a 20 min sec. L'attività è stata definita come la velocità massima residua dell'enzima dopo incubazione di calore. Dei quattro candidati scelti casualmente per l'ulteriore caratterizzazione, mutante 29C3 mostrato il comportamento più avanzato termico. Il comportamento termico di WT PlyC e 29C3 stata studiata a diverse temperature, mentre incubando e saggiare per l'attività in PBS pH 7,2 a80 Nm e 40 concentrazioni nM, rispettivamente. Gli esperimenti 45-50 ° C incubazione (Figura 3) sono state eseguite in un termociclatore dove sono state incubate i campioni in una parete sottile piastra 96 termociclatore bene in un volume totale di 120 microlitri. Il 35 ° C, 40 ° C e 45 ° C esperimenti di incubazione (Figura 4 e 5) sono state eseguite in un blocco di calore in cui i campioni sono stati incubati in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml in un volume totale di 1,3 ml. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato.

WT PlyC e 29C3 mostrato alcuna differenza significativa nella stabilità cinetica a temperatura ambiente (25 ° C) come descritto nel primo gruppo di barre in figura 3. Tuttavia, dopo un breve periodo di incubazione per 30 minuti da temperature comprese tra 45-50 ° C, l'attività di 29C3 era sostanzialmente maggiore attività specifica al WT costruire temperatura in ogni punto. Per esempio, WT PlyC visualizzata una perdita del 44% dell'attività al 45,2° C mentre 29C3 mostrato solo una perdita del 2% in attività alla stessa temperatura.

Studi a lungo termine incubazione paragonando l'attività residua sia PlyC WT e 29C3 state addizionalmente effettuata a 35 ° C e 40 ° C che coinvolge la misurazione di attività residua a 24 e 48 punti temporali hr. A 35 ° C, 41% 29C3 visualizzato e attività 176% rispetto WT PlyC a 24 e 48 ore di incubazione punti temporali, rispettivamente (figura 4a). A 40 ° C, 28% 29C3 visualizzato e attività 107% rispetto WT PlyC a 24 e 48 ore di incubazione punti temporali, rispettivamente (Figura 4b).

L'attività residua di WT PlyC e 29C3 stata controllata anche ogni 20 min per un totale di 3 ore a 45 ° C. WT PlyC stato solo in grado di trattenere il 21% di attività dopo una incubazione 3 ore a questa temperatura, mentre 29C3 è stato in grado di trattenere il 46% di attività. L'emivita (t _1/2) per WT PlyC e 29C3 erano 67 e 147 minuti, rispettivamente, suggeriscono zione che 29C3 ha un 2,2 volte più elevata stabilità cinetica a 45 ° C (Figura 5).

Totale Round 1 Candidati	35
I candidati con sequenza WT PlyCA	7
I candidati con ≥ 1 Mutazione Amino Acid	28
- Tariffa Media Mutation nucleotidi (nt / plyCA)	2,75
- Gamma mutazione nucleotidica (nt)	1-6
- Media Mutation Amino Acid Tasso (AA / PlyCA)	1,9
- Gamma Amino Acid Mutazione (AA)	1-5

Tabella 1. Candidato Pool analisi genomica.

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Figura 1. Regia metodologia di analisi l'evoluzione. Nel evoluzione diretta, si parte con l'enzima di piombo, che sarebbe PlyC WT per il primo turno. Una libreria di mutanti PlyC contenenti mutazioni casuali imparziali nucleotidiche del gene plyCA viene costruito da un soggetto a errori DNA polimerasi, clonato nel vettore di espressione pBAD24 e trasformato in E. coli ceppo DH5a già contenente pBAD33:. plyCB trasformanti individuali vengono inoculati nel loro specifico proprio pozzetto di una piastra a 96 pozzetto della micropiastra. Attraverso un processo di screening ampio, singoli mutanti PlyC che sono cataliticamente attivo dopo incubazione a una temperatura non ammissibile sono classificati come mutanti con maggiore stabilità cinetica. Theconstruct visualizzare il comportamento più progredito termica diventa di conseguenza l'enzima principale per il prossimo ciclo di mutagenesi casuale. Nel complesso, ci sono tre giri completi di random mutagenesi seguito da rimescolamento del DNA causando una molecola bacteriolytic con evoluto comportamento termico. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. 96 pozzetti microtitolo modelli per il dosaggio evoluzione diretta. Lo schema micropiastra durante la determinazione delle condizioni ottimali di riscaldamento (Figura 2a) consiste di inoculando un singolo clone parentale WT PlyC in ciascuna riga della micropiastra. Lo schema micropiastra durante lo screening mutante (Figura 2b) consiste di inoculo ciascun pozzetto della colonna 1 con un unico clone parentale WT PlyC così come inoculo in ciascun pozzetto colonne 2-12 con un distinto clone PlyC mutante. Wells A1-D1 sono designati per i controlli positivi dei genitori, che coPretendi di WT PlyC non costrutti esposti a non consentita temperatura di incubazione. Wells E1-H1 sono designati per i controlli negativi parentali, che consistono di WT PlyC costrutti che sono esposti a non ammessa temperatura di incubazione.

Figura 3. Analisi dell'attività cinetica residua confronto WT PlyC e 29C3. Enzimi sono purificati ad omogeneità e incubate per 30 minuti in un termociclatore a concentrazioni molari uguali ai due temperatura ambiente o ad un gradiente di temperatura da 45-50 ° C. Enzimatica correla con la massima velocità visualizzata dopo incubazione temperatura specifica. Con l'eccezione di 25 ° C e 47,7 ° C, la variazione di attività tra WT e 29C3 a ciascuna temperatura correlata ad un valore p <0,05. Tutti i dati sono riportati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti.

Figura 4. Analisi dell'attività cinetica residua confronto WT PlyC al 29C3 a 35 ° C e 40 ° C. Le concentrazioni molari di pari purificato WT PlyC 29C3 e sono stati incubati in un blocco di calore a 35 ° C (Figura 4a) o 40 ° C (Figura 4b). L'attività enzimatica residua è stata misurata a 24 e 48 punti temporali hr. L'attività visualizzata da ciascun costrutto è stato normalizzato alla velocità massima visualizzata al tempo zero punto. La variazione di attività tra WT e 29C3 in ogni punto la temperatura e il tempo correlato ad un valore di p <0.05. Tutti i dati sono riportati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti.

Figura 5. Attività di analisi cinetica residua a confrontoWT PlyC al 29C3 a 45 ° C. Le concentrazioni molari di pari purificato WT PlyC 29C3 e sono stati incubati in un blocco di calore a 45 ° C e l'attività enzimatica residua è stata misurata ogni 20 minuti per 3 ore. L'attività visualizzata da ciascun costrutto è stato normalizzato alla velocità massima visualizzata al tempo zero punto. Con l'eccezione dei punti dati a 20 min, la variazione di attività tra WT e 29C3 ad ogni tempo correlato ad un valore p <0,05. Tutti i dati sono riportati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti.

Discussion

Questo protocollo, illustrato in figura 1, presenta una metodologia ben 96 micropiastra che permette di utilizzare evoluzione diretta ad aumentare la termostabilità di qualsiasi enzima bacteriolytic. Attraverso l'uso di un soggetto a errori DNA polimerasi, si possono introdurre mutazioni casuali che aumentano la stabilità cinetica della molecola tradotto bacteriolytic di interesse, che è tipicamente dovuta a riorganizzazioni molecolari costituiti aumentando elettrostatica, ponte disolfuro e interazioni idrofobiche che generano migliorata imballaggio molecolare, modifiche avanzate di reti di carica di superficie o il rafforzamento di uno stato di oligomerizzazione maggiore ^17-18. Dopo l'introduzione di mutazioni nucleotidiche, una procedura di screening esteso è stato poi utilizzato per identificare mutazioni che sono termicamente benefico. I risultati rappresentativi qui presentate sono basate su un round di mutagenesi casuale. In realtà, è stato suggerito chealmeno tre cicli successivi di mutagenesi casuale, ciascuno utilizzando il mutante più robusto come enzima piombo, seguito da rimescolamento del DNA è appropriato per questi tipi di studi diretti comportamento evoluzione termica ^2.

E 'importante capire che, mentre questo protocollo identifica mutazioni che aumentano la stabilità cinetica, queste varianti non necessariamente sono aumentati termostabilità. Una molecola è considerata termostabile quando si ha la capacità di mantenere la sua struttura ad alta temperatura. Tuttavia, nel saggio presentato, l'attività residua dei lisati mutanti non sono saggiati alla stessa temperatura che erano inizialmente incubate a durante la fase di trattamento termico e quindi uno può essere selezionato per mutazioni che promuovono refolding anziché termostabilità maggiore ^19. Mentre stiamo estrapolando comportamento termico come indicazione di stabilità termica, stabilità termica vera deve essere misurata empiricamente biophysmetodi ical quali dicroismo circolare (CD), calorimetria a scansione differenziale (DSC) e la scansione differenziale fluorimetria (DSF). I dati preliminari di esperimenti di CD e DSF suggeriscono che numerosi candidati individuati dalla metodologia presentata effettivamente visualizzare termostabilità progredito (dati non riportati).

Anche se la metodologia qui presentata è specifico per l'attuazione aumentato comportamento termico a PlyC, questo stesso metodo può inoltre essere impiegato per migliorare l'attività termica ad altri enzimi bacteriolytic con alcune piccole modifiche alle variabili come tamponi, i tassi di mutazione, le condizioni di riscaldamento e sistemi di espressione. Una variabile critica associato con questo saggio si riferisce al tasso di mutazione del nucleotide error-prone DNA polimerasi. Abbiamo scelto di utilizzare il soggetto a errori Mutazyme DNA polimerasi II nel nostro saggio evoluzione diretta a causa di evidenze sperimentali suggeriscono questo particolare enzima mostra il minor numero di errori conriguarda nucleotidi che sono casualmente incorporati nel gene di interesse rispetto ad altre tecniche di mutagenesi random, quali l'uso di idrossilammina, mutator E. coli e altri soggetti a errori DNA polyermases ^20. In generale, i tassi di mutazione inferiori tendono ad essere più desiderabile per due ragioni. Primo, termostabilità ingegneria a proteine ​​costituito tipicamente relativamente poche sostituzioni di amminoacidi. Tassi di mutazione elevate possono causare drammatici alterazioni strutturali a particolari molecole che possono causare definitivamente misfolding strutturale e differenze funzionali. Ad esempio, l'incorporazione di glicina e residui di prolina può disturbare alfa strutture elicoidali secondarie ^21. In secondo luogo, gli alti tassi di mutazione nucleotidiche aumentare le possibilità di incorporare prematuri codoni di stop, con conseguente molecole tronche che sono biologicamente inattivo. In generale, i tassi di mutazione più bassi sono da preferire in quanto risultato di errore inferiore tassi nel accumulzione delle mutazioni adattive mentre i tassi più elevati di mutazione generare mutazioni neutrali o deleterio ^22.

Per ogni ciclo di mutagenesi casuale, un'altra variabile critica che si deve ottimizzare comporta la temperatura di incubazione usato durante il processo di screening. Selezione del sperimentale non permissivo temperatura è relativamente difficile. Inizialmente abbiamo usato una temperatura di incubazione, che era di 10 ° C superiore alla temperatura non permissiva di PlyC, però dopo aver visionato 3000 mutanti, siamo stati in grado di individuare eventuali mutazioni vantaggiose. Tenendo presente metodologie evoluzione diretta consistono di identificazione sequenziale benefiche sostituzioni amminoacidiche che hanno effetti additivi, è stato determinato che una temperatura meno stringente deve essere usato durante il processo di screening anche se è aumentata la probabilità di generare falsi positivi. Come tale, abbiamo utilizzato una temperatura di incubazione era solo pochi gradi sopra la non pressione maxtemperatura ive e ricontrollati candidati selezionati per escludere i falsi positivi.

Abbiamo deciso di utilizzare una temperatura di incubazione che non era troppo temperato (≤ 1 ° C superiore a quella minima non permissivo temperatura) e viceversa non troppo duro (≥ 5 ° C superiore a bassa temperatura non permissive). La temperatura ideale abbiamo deciso di utilizzare in questa particolare dosaggio era un moderato 2 ° C superiore al determinato sperimentalmente non permissivo temperatura. Scegliendo una temperatura troppo mite si tradurrà in un più alto tasso di falsi positivi identificazione del ~ 20% abbiamo osservato (Tabella I) quando si utilizza una temperatura moderata incubazione. Inoltre, utilizzando una temperatura di incubazione che è troppo dura potrebbe concludersi con l'incapacità di identificare mutanti con significativamente migliorato comportamento termico. Ad esempio, utilizzando una temperatura di incubazione di ≥ 5 ° C avrebbe comportato l'impossibilità di individuare ilpromettendo mutante 29C3 così come la maggior parte degli altri candidati selezionati durante il primo round di screening.

In sommatoria, forniamo un protocollo per enzimi di ingegneria bacteriolytic per acquisire una migliore stabilità cinetica. Inoltre, questo saggio stesso, senza le fasi di riscaldamento, può essere usato per individuare mutazioni che aumentano l'attività catalitica. Aumentare sia l'attività catalitica e stabilità termica è un ostacolo importante allo sviluppo di fronte a qualsiasi enzima terapeutico. Mentre i dettagli di questo protocollo sono specifiche del PlyC endolysin, il metodo può essere adattato a qualsiasi enzima bacteriolytic con solo alcune modifiche. Abbiamo presentato risultati preliminari dal solo primo ciclo di mutagenesi che convalida la funzionalità del test, con conseguente attuazione e l'identificazione di mutazioni che generano un aumento termostabilità molecolare di rilevante entità.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
B-PER II proteica batterica reagente di estrazione	Thermo Scientific	78260
GeneMorph II Kit mutagenesi casuale	Agilent Technologies	200500
Cancella 96 pozzetti, fondo piatto piastra con un coperchio	BD Vacutainer Labware Medical	353072
96 Piastre PCR Bene Nonskirted	Fisher Scientific	14-230-232
Rotore basculante	Eppendorf	A-2-DWP
Ampicillin Sodium Salt	Fisher Scientific	BP1760
Cloramfenicolo	Fisher Scientific	BP904
Arabinose	Fisher Scientific	BP2504
pBAD24 vettore di espressione	ATCC	87399
pBAD33 vettore di espressione	ATCC	87402