Imaging non invasivo di acuta Alloinnesto rigetto dopo trapianto renale Rat Utilizzo<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG PET

Alexander Grabner; Dominik Kentrup; Uta Schnöckel; Gert Gabriëls; Rita Schröter; Hermann Pavenstädt; Otmar Schober; Eberhard Schlatter; Michael Schäfers; Stefan Reuter

doi:10.3791/4240

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Articolo metodologico

Imaging non invasivo di acuta Alloinnesto rigetto dopo trapianto renale Rat Utilizzo

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DOI:

10.3791/4240

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28 aprile 2013

Alexander Grabner^*¹ , Dominik Kentrup^*¹ , Uta Schnöckel² , Gert Gabriëls¹ , Rita Schröter¹ , Hermann Pavenstädt¹ , Otmar Schober² , Eberhard Schlatter¹ , Michael Schäfers^*³ , Stefan Reuter^*¹

¹Department of Internal Medicine D, Experimental Nephrology, University of Münster, ²Department of Nuclear Medicine, University of Münster, ³European Institute for Molecular Imaging, University of Münster

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Siamo qui presentiamo un modello di trapianto di rene di ratto per valutare in modo non invasivo rigetto acuto utilizzando la tomografia ad emissione di positroni con 18F-fluorodeossiglucosio.

Abstract

Il numero di pazienti con malattia renale allo stadio terminale, e il numero di riceventi trapianto allogenico di rene aumenta continuamente. Gli episodi di rigetto acuto cellulare (AR) sono un fattore prognostico negativo per la sopravvivenza del trapianto a lungo termine, e la sua diagnosi tempestiva è fondamentale per la funzionalità dell'organo trapiantato ^1. Allo stato attuale, AR può essere definitivamente diagnosticata solo mediante biopsia core-ago, che, come un metodo invasivo, scopre significativo rischio di lesioni o addirittura la perdita dell'innesto. Inoltre, le biopsie non sono fattibili in pazienti che assumono farmaci anticoagulanti e il sito di campionamento limitato di questa tecnica può portare a risultati falsi negativi se l'AR è focale o irregolare. Di conseguenza, questo ha dato luogo a una continua ricerca di nuovi metodi di rilevazione AR, che spesso deve essere fatto in animali, compreso l'uso di vari modelli di trapianto.

Dall'inizio degli anni '60 il trapianto renale ratto è un metodo sperimentale consolidata per l'esazione e l'analisi di AR ^2. Noi qui presenti oltre piccola tomografia a emissione di positroni animali (PET) con ¹⁸ F-fluorodeossiglucosio (FDG) per valutare AR in un ratto uninephrectomized renale modello di trapianto allogenico e proporre innesto di imaging FDG-PET come una nuova opzione per un non-invasiva, specifica e la diagnosi precoce di AR anche per la situazione umana ^3. Inoltre, questo metodo può essere applicato per il follow-up per migliorare il monitoraggio del rigetto del trapianto ^4.

Protocollo

1. Donor Recovery Organ

Impostare il microscopio stereotassica, record di peso del 8-10 settimane di età ratto (donatore e ricevente di peso corporeo dovrebbe corrispondere).
Anestetizzare il topo donatore (Lewis Brown Norway F1, LBN F1) con ossigeno / inalazione isoflurano (isoflurano 4% / 2 L / min di ossigeno). Mantenere l'anestesia abbassando isoflurano al 2-2,5%.
Posizionare il topo anestetizzato sul pad chirurgia. Fissare le estremità del ratto con del nastro adesivo sul tampone e applicare pomata oftalmica (Bepanthen, Bayer) agli occhi del ratto.
Shave e disinfettare l'addome del ratto e di eseguire una incisione mediana ventrale dal pube fino al confine caudale del fegato. Esporre il rene sinistro e sue navi spostando attentamente l'intestino per il lato destro. Posizionare un foglio sottile di garza sul rene sinistro e inumidire con soluzione salina isotonica riscaldata per prevenire l'essiccamento.
Sezionare con cura il tessuto adiposo con Dumont angolati Pinze Tip (Dumont SS-45 Pinza Inox Medical, Belle Strumenti Scienza, Cat.No. 11.203-25) che avvolge l'uretere sinistro. Evitare il contatto diretto con l'uretere, invece, mobilitare con sufficiente tessuto adiposo circostante.
Separare la vena renale sinistra dall'arteria renale utilizzando Dumont angolati pinzetta Tip. Rimuovere tutti i grassi e tessuto connettivo da entrambe le navi e cauterizzare i vasi surrenali e testicoli.
Sezionare aorta e vena cava inferiore (IVC) sopra e sotto l'incrocio con l'arteria renale sinistra e la vena, rispettivamente, e cauterizzare tutte le arterie in uscita.
Bloccare l'aorta surrenale con un morsetto microchirurgico (micro Serrefines, Belle Strumenti Scienza, art 18055-04) sopra l'arteria renale sinistra, il più vicino possibile al dell'arteria mesenterica superiore. Legare l'aorta sottorenale con seta chirurgico (5-0, Vömel, arte no. 14739) di circa 5 mm sotto l'arteria renale sinistra.
Legare la IVC sottorenale con seta chirurgico (5-0, Vömel), e bloccare la surrenale IVCcon un morsetto microchirurgico (micro Serrefines, Fine strumenti per le scienze, art 18055-03).
Tagliare la vena renale il più vicino possibile alla IVC con le forbici sottili (Iris Forbici - ToughCut dritte 11,5 centimetri, Fine strumenti per le scienze, art 14058-11).
Perfusione Lentamente il rene in situ con 2 ml di soluzione di perfusione HTK ghiacciata (CUSTODIOL HTK, Dr. Franz Köhler Chemie) con l'inserimento di una cannula (Microlance 3 27G ¾, BD, art 302200) in aorta sottorenale. Confermare che i cambiamenti di colore renali (ora oliva colorato).
Prima, transezione dell'aorta surrenale, poi l'aorta sottorenale e infine dell'uretere più vicino possibile alla vescica urinaria.
Rimuovere il rene e il suo apporto vascolare con l'uretere e conservare in soluzione di perfusione HTK sul ghiaccio.
Euthanize il topo donatore rimuovendo i morsetti vascolari e l'escissione consecutivo di cuore in anestesia.

2. Destinatario Preparazione e trapiantozione

Impostare il microscopio stereotassica, peso record di ratto.
Anestetizzare il ratto destinatario (Lewis) utilizzando isoflurano 4%. Mantenere l'anestesia abbassando isoflurano al 2-2,5%.
Posizionare il topo anestetizzato sul pad chirurgia. Fissare le estremità del ratto con del nastro adesivo sul tampone e applicare pomata oftalmica per gli occhi il ratto `s. Monitorare e controllare la temperatura corporea interna utilizzando un sensore di temperatura rettale e un pad di riscaldamento. Durante la chirurgia controllare ripetitivamente temperatura, la respirazione e la frequenza cardiaca dell'animale.
Shave e disinfettare l'addome ed eseguire una incisione mediana ventrale dal pube fino al confine caudale del fegato. Utilizzare un bisturi forcutting la pelle al fine di minimizzare il trauma pelle. Esporre il rene sinistro e sue navi spostando l'intestino per il lato destro.
Rimuovere con cautela la capsula renale utilizzando Dumont angolati pinzetta TIP e tamponi di cotone.
Occludere sinistra dell'arteria renale, vena e uretere vicino renaleilo con due legature con filo chirurgico (Mersilene 4-0, Ethicon, cat. n. EH6732H). Asportare il maggior parte del rene, lasciando solo l'ilo renale. Pulire la superficie di taglio con tamponi di cotone e di verificare la presenza di sanguinamento. Aggiungi un'altra legatura, se necessario.
Sezionare con cura senza mezzi termini attraverso il tessuto connettivo che copre l'aorta sottorenale e vena cava sul sito caudale con tamponi di cotone.
Separare ogni nervo visibile dalla aorta sottorenale e vena cava usando Dumont angolati pinzetta Tip.
Sezionare attentamente il foglio di tessuto connettivo tra l'aorta sottorenale e vena cava, formando due aperture di 2-4 mm di lunghezza: Il primo sotto la ramificazione dei vasi testicolari, e la seconda sopra la ramificazione dei vasi iliaci comuni. Cauterizzare le arterie e le vene iliolumbar in mezzo.
Disegnare un unico filo chirurgico (Mersilene 0;. Ethicon, cat no.EH6665E) in ciascuna delle due aperture. Utilizzando questi fili tirare il sottorenaleaorta e vena cava delicatamente il lato destro dell'animale per accedere ai vasi ramificazione sul sito dorsale. Cauterize qualsiasi di questi vasi tra le due aperture e rimuovere i fili chirurgici successivi.
Avanti, occludere l'aorta e vena cava inferiore per l'applicazione in senso orario di quattro morsetti di microchirurgia (Micro Serrefines, Belle Strumenti Scienza, art 18055-04) che cominciano in apertura superiore con l'aorta e termina con la vena cava in apertura superiore (Micro Serrefines , Belle Strumenti Scienza, art 18055-03).
In seguito con attenzione perforare il finale superiore della parte isolata dell'aorta con un ago (Microlance 3 27G ¾, BD, art 302200), inserire la lama inferiore di una forbice fine primavera (Spring Vännäs Forbici - 3 mm Lamelle, raffinata Scienza Strumenti, cat.no 15.000-00) attraverso l'apertura puntura ed eseguire una breve incisione longitudinale. Lavare l'aorta isolata con ghiacciata soluzione di perfusione HTK per rimuovere il sangue residuo.
Allo stesso modo, con attenzione perforareil finale inferiore della parte isolata della vena cava con un ago, inserire la lama inferiore di una multa forbice molla attraverso l'apertura puntura ed eseguire una incisione longitudinale che termina poco sotto l'incisione aortica. Ancora una volta, lavare il vaso per rimuovere il sangue residuo.
Rimuovere il trapianto di rene dalla soluzione di storage. E posizionarla sotto la precedente posizione del rene sinistro, e assicurarsi che sia orientata correttamente.
Controllare l'orientamento della arteria renale innesti e garantire che non ci sono colpi di scena. Quindi posizionare un foglio sottile di garza sopra l'innesto ed inumidire con soluzione di perfusione HTK ghiacciata per raffreddarlo, e per prevenire l'essiccamento.
Fissare l'apertura della parte surrenale del pezzo aortica in cui l'arteria renale dell'innesto si apre con filo chirurgico (Ethilon 9-0, Ethicon, cat n 2809G..) - Prima al superiore, quindi all'estremità inferiore di l'incisione aortica. Chiudere l'incisione in senso orario con una sutura continua con filo chirurgico(Ethilon 9-0), Dumont angolati pinzetta punta ed un porta aghi Castroviejo curvo (Belle Strumenti Scienza, cat. N. 12061-01). Successivamente, coprire la prima sutura con tessuto connettivo attraverso una seconda sutura continua antiorario. Ora, solo la parte inferiore del pezzo aortica dell'innesto rimane da chiudere. Regolarmente raffreddare l'innesto con ghiacciata soluzione di perfusione HTK.
Profumato l'innesto con 1 ml di ghiacciata soluzione di perfusione HTK attraverso un ago smussato inserito nell'estremità aperta del pezzo aortica innesti convalidare la tenuta e l'integrità della sutura, così come la rimozione di sangue rimanente nel trapianto. Successivamente, legare l'estremità aperta del pezzo aortica con seta chirurgica (5-0, Vömel).
Controllare l'orientamento della vena renale innesti e garantire che non ci sono colpi di scena.
Fissare l'apertura della vena dell'innesto con filo chirurgico (Ethilon 9-0) - prima la tomaia, poi all'estremità inferiore della incisione alla vena cava. Chiudere l'incisionein senso orario con una sutura continua con filo chirurgico (Ethilon 9-0), Dumont angolati pinzetta punta ed un porta ago curvo Castroviejo. Regolarmente raffreddare l'innesto con ghiacciata soluzione di perfusione HTK.
Antiorario rimuovere le fascette di microchirurgia, a cominciare dalla vena cava superiore morsetto. Dopo aver rimosso l'ultimo morsetto aortica, stop attentamente emorragia finalmente mite con tamponi di cotone. Dopo pochi secondi l'innesto diventa roseo-tinta, e contrazioni uretric dovrebbe apparire.
Per l'inserimento del innesti dell'uretere in vescica `s il destinatario rimuovere con attenzione una piccola zona della muscolatura nella parte superiore della vescica utilizzando un Vannas Primavera Forbice (Studente Vannas Primavera Scissor Diritto, fine Strumenti di scienze, Cat.No. 91.500-09 ). Quindi, rimuovere il tessuto circostante (per lo più grasso) da dell'uretere innesto utilizzando Dumont angolati pinzetta Tip. Pertanto, afferrare con attenzione la punta dell'uretere e delicatamente separare il circostante grasso, tessuto connettivo e vasi incorporati froM essa tirando in senso opposto. Fissare la punta uretric al termine di un filo chirurgico (Prolene 6-0, Ethicon, cat. No. 8697H) e perforare la parte superiore della vescica con l'ago inserito precedentemente preparato. Tirare l'uretere attraverso la vescica e uscirne alla base attraverso una seconda perforazione.
Fissare la precedenza dagli ureteri separato tessuto nella parte superiore della vescica con filo chirurgico (Ethilon 9-0). Tagliare la punta del uretere con il filo chirurgico annesso e tirare l'uretere nella vescica spingendo delicatamente dal basso. Successivamente, chiudere la seconda puntura vescicale con filo chirurgico (Ethilon 9-0).
Chiudere la parete addominale e la pelle da due suture continue ma separate utilizzando filo di sutura chirurgico (Mersilene 0). Disinfettare la ferita con Pividon Iodio e amministrare buprenorfina (0,1 mg per kg / BW / bid) sc per tre giorni dopo l'intervento chirurgico per controllare il dolore delle ferite.

3. Imaging Allograft Rifiuto

Anestetizzare ratto non a digiuno con isoflurano 2-2,5%.
30 MBq FDG (30 MBq FDG in 0,1 ml 0,9% NaCl) sono somministrati iv tramite cateterizzazione una vena della coda laterale utilizzando un catetere G 24 (Braun, Introcan, 4.252.500-01). In seguito, spurgare il catetere con 0,9 ml di soluzione di NaCl allo 0,9%.
Lasciare il topo in un dispositivo di immobilizzazione senza anestesia fino all'inizio della scansione e idratare l'animale da iniezione endovenosa di 1 ml di soluzione di NaCl allo 0,9% ogni ora.
Rat ri-anestetizzare con isoflurano 2% subito prima che la ricerca inizi.
Mettere ratto anestetizzato in una ad alta risoluzione da camera-based multi-filo animale PET fotocamera quadHIDAC (Oxford Positron Systems Ltd, Oxford, UK). La risoluzione spaziale della PET scanner è di 1,0 mm ed è costante su tutta FOV (diametro, 165 mm; lunghezza assiale di 280 mm). Monitoraggio e controllo della temperatura corporea durante la scansione utilizzando un sensore di temperatura rettale e l'anestesia controllo con un ossimetro di impulso.
Avviare acquisizione dinamica di 60 min partenza 180 min dopo la FDG-iniezione per ridurre l'accumulo di tracciante nei reni causati dalla escrezione renale di FDG.
Applicare 5 MBq di ¹⁸ F-fluoro iv ed eseguire un'altra scansione PET immediatamente dopo l'iniezione ¹⁸ F-fluoro per 60 min senza spostare la posizione del ratto nello scanner per l'identificazione di parenchima renale e per il calcolo del ¹⁸ F-spazio ^5. Ricostruire le immagini da entrambe le scansioni. Tracciare manualmente un volume di interesse (VOI) sulle immagini ricostruite 2 min dopo l'iniezione di ¹⁸ F-fluoruro (perfusione-fase) intorno corteccia renale e trasferire il VOI alle immagini FDG. Escludere attentamente la pelvi renale da VOI. Ricostruire le immagini da entrambe le scansioni e tracciare manualmente un volume di interesse (VOI) intorno corteccia renale. Dati list-mode sono stati ricostruiti in immagini con una dimensione voxel di 0,4 × 0,4 × 0,4 millimetri ^3. Escludere attentamente la pelvi renale da VOI.
Calcola FDG per il rapporto of conteggi totali e il volume e calcolare la percentuale della dose iniettata (% ID). Abbiamo usato MATLAB (versione R2011b, MathWorks, Natick, MA, USA) e di imaging tomografico (TIM) Versione 2.8 per l'analisi delle immagini.