Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione di un DNA a doppio filamento proteina pausa segnalazione attivato in risposta al danno del DNA e la sua localizzazione durante la mitosi.
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Articolo metodologico
Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine danno al DNA di risposta
In questo articolo
Sommario
Abstract
Rotture del doppio filamento (DSB) sono il DNA più deleteria lesioni una cella può incontrare. Se lasciato non riparati, DSB potenziale grande porto per generare mutazioni e aberrazioni cromosomiche 1. Per evitare questo trauma da catalizzare l'instabilità genomica, è fondamentale per le cellule per individuare DSB, attivare la risposta al danno al DNA (DDR), e riparare il DNA. Quando stimolato, il DDR lavora per preservare l'integrità genomica innescando arresto del ciclo cellulare per consentire la riparazione abbia luogo o forzare la cellula a subire apoptosi. I meccanismi predominanti di riparazione DSB avvenire attraverso nonhomologous end-joining (NHEJ) e ricombinazione omologa riparazione (HRR) (recensione in 2). Ci sono molte proteine la cui attività deve essere orchestrato con precisione per la DDR per funzionare correttamente. Qui, si descrive un metodo per 2 - e 3-dimensionale (D) visualizzazione di una di queste proteine, 53BP1.
Il p53-binding protein 1 (53BP1) localizza alle aree diDSB legandosi agli istoni modificati 3,4, la formazione di focolai entro 5-15 minuti 5. Le modifiche degli istoni e di assunzione di proteine e di altri 53BP1 DDR a siti DSB si ritiene di facilitare la riorganizzazione strutturale della cromatina intorno alle aree di danno e contribuire alla riparazione del DNA 6. Al di là di partecipazione diretta nella riparazione, altri ruoli sono stati descritti per 53BP1 nella Ddr, quali la regolazione di un intra-S checkpoint, un G2 / M checkpoint, e l'attivazione di proteine a valle DDR 7-9. Recentemente, è stato scoperto che 53BP1 non forma foci in risposta al danno del DNA indotto durante la mitosi, invece attesa cellule a entrare G1 prima localizzazione per la vicinanza DSBs 6. Proteine DDR come 53BP1 sono stati trovati per associare strutture mitotiche (come cinetocori) durante la progressione attraverso la mitosi 10.
In questo protocollo si descrive l'uso di 2 - e 3-D imaging cellule vive per visualizzarela formazione di foci 53BP1 in risposta al danno del DNA agente camptotecina (CPT), così come il comportamento 53BP1 durante la mitosi. Camptotecina è un inibitore della topoisomerasi I che causa principalmente DSBs durante la replicazione del DNA. Per fare questo, abbiamo utilizzato un precedentemente descritto 53BP1-mCherry proteina di fusione fluorescente costruire costituito da un dominio 53BP1 proteina in grado di legare DSB 11. Inoltre, abbiamo utilizzato un istone H2B-proteina di fusione GFP fluorescente costrutto in grado di monitorare la dinamica della cromatina durante il ciclo cellulare, ma in particolare durante la mitosi 12. Imaging cellulare Live in molteplici dimensioni è un ottimo strumento per approfondire la nostra comprensione della funzione delle proteine DDR nelle cellule eucariotiche.
Protocollo
A. Preparazione cellulare
- Normali fibroblasti umani primari (GM02270) sono stati ottenuti da Repository cella Coriell, Camden, New Jersey, e immortalato con hTERT 6. Le cellule sono state coltivate ed espanse in Cellstar 6 centimetri piatti a mezzi (4 ml) costituiti MEM supplementato con 20% siero fetale bovino (GIBCO), non-essential/essential aminoacidi, vitamine, sodio piruvato, e penicillina / streptomicina (HyClone ).
- Rene embrionale umano 293 (HEK293) cellule sono state ottenute dalla American Type Culture Collection e coltivate ed espanse in Cellstar 6 centimetri piatti. Le cellule sono state mantenute in mezzi (4 ml) costituito ....
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Discussione
Mantenimento dell'integrità genomica è fondamentale per la sopravvivenza delle cellule. La mancata conservare i risultati del genoma in invecchiamento precoce, carcinogenesi o morte 8. C'è forte interesse a discernere come funziona il DDR, derivanti dalla sua importanza per la ricerca di base e clinica. Molte tecniche sono state sviluppate nel corso degli anni per aiutare nello studio di come le cellule di rilevare e riparare i danni del DNA. I metodi tradizionali, quali immunocitochimica e Western bl.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Supportato in parte da R01NS064593 e R21ES016636 (KV). Microscopia è stata eseguita presso il VCU - Dipartimento di Neurobiologia e Microscopia strumento Anatomia, sostenuta, in parte, con i fondi NIH NINDS-Centro nucleo concessione 5P30NS047463. Il microscopio confocale disco rotante è stato acquistato con un NIH-NCRR premio (1S10RR027957).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Prodotto | Azienda | ||
| Cellstar cultura piatti | Greiner Bio-One | ||
| FluroDish piatti di vetro con fondo | Mondo Strumenti di precisione, Inc. | ||
| MEM supporti | GIBCO | ||
| Aminoacidi non essenziali | GIBCO | ||
| Amminoacidi | GIBCO | ||
| Vitamine | GIBCO | ||
| Sodio piruvato | Invitrogen | ||
| Penicillina / streptomicina | HyClone | ||
| Siero fetale bovino | GIBCO | ||
| N-Myc-53BP1 PLPC WT-Puro; plasmide 19836 | Addgene | ||
| pCLNR-H2BG; plasmide 17735 | Addgene | ||
| Superfect | Qiagen | ||
| Zeiss cellulare Observer SD Imaging sistema | Zeiss | ||
| AxioVision (versione 4.8.2) | Zeiss | ||
| Zeiss Immersol W Olio | Zeiss | ||
| Volocity software (versione 6.0) | PerkinElmer |
Riferimenti
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T.
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Ristampe e permessi
