Esame di Selezione timica positivi e negativi per Citometria a Flusso

Summary

Vi presentiamo un metodo basato citometria di flusso per esaminare lo sviluppo delle cellule T In vivo Utilizzando topi geneticamente manipolati su un tipo selvatico o T sfondo recettore delle cellule transgeniche.

Abstract

Un sistema immunitario sano è necessario che le cellule T rispondono agli antigeni estranei, pur rimanendo tolleranza di auto-antigeni. Riarrangiamento casuale del recettore delle cellule T (TCR) α e β loci genera un repertorio T cella con grande diversità nella specificità antigenica, sia per sé ed esteri. Selezione del repertorio durante lo sviluppo nel timo è critica per generare le cellule T sicuro e utile. Difetti di selezione timica contribuire allo sviluppo di malattie autoimmuni e immunodeficienza ^1-4.

Progenitori delle cellule T inserire il timo come doppi negativi (DN) timociti che non esprimono CD4 o CD8 co-recettori. Espressione del αβTCR ed entrambi co-recettori avviene a doppio positivo (DP) stadio. Interazione del αβTCR con auto-peptide-MHC (pMHC) presentata da parte delle cellule del timo determina il destino del timociti DP. Interazioni ad alta affinità portare alla selezione negativa e di eliminazionezione di auto-reattivi timociti. Bassa affinità risultato interazioni in selezione positiva e sviluppo di CD4 o CD8 singoli positivi (SP) cellule T capaci di riconoscere antigeni estranei presentati da auto-MHC ^5.

Selezione positiva può essere studiata in topi con un anticorpo (tipo selvatico) repertorio TCR osservando la generazione di cellule T mature. Tuttavia, essi non sono ideali per lo studio di selezione negativa, che comporta l'eliminazione di piccoli antigene-specifiche popolazioni. Molti sistemi modello sono stati utilizzati per studiare selezione negativa, ma variano nella loro capacità di ricapitolare eventi fisiologici ^6. Per esempio, stimolazione in vitro dei timociti manca dell'ambiente timica che è intimamente coinvolto nella selezione, mentre la somministrazione di antigene esogeno può portare a non-specifico delezione di timociti ^7-9. Attualmente, i migliori strumenti per lo studio in vivo selezione negativa sono topi che esprimono una transgENIC specifico TCR per endogena auto-antigene. Tuttavia, molti classici modelli transgenici TCR sono caratterizzati dalla prematura espressione della catena transgenico TCRα nella fase DN, con conseguente prematuro selezione negativa. Il nostro laboratorio ha sviluppato il modello HY ^cd4, in cui il transgenico HY TCRα condizionatamente espressa nella fase DP, consentendo la selezione negativa a verificarsi durante il DP di transizione SP come avviene nei topi di tipo selvatico ^10.

Qui, si descrive un protocollo basato citometria di flusso per esaminare timica selezione positiva e negativa nel topo HY modello ^CD4. Mentre la selezione negativa in topi ^CD4 HY è altamente fisiologica, questi metodi possono essere applicati anche ad altri modelli transgenici TCR. Ci sarà anche la presentazione delle strategie generali per l'analisi di selezione positiva in un repertorio policlonale applicabile a tutti i topi geneticamente manipolati.

Protocol

Fare riferimento alla Figura 1 per uno schema generale del protocollo sperimentale.

1. Dissezione

1. Luogo sterile setaccio a maglia d'acciaio in 60 x 15 millimetri capsula di Petri. Una unità è necessaria per campione di tessuto.
2. Aggiungere 5 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a ogni piatto. Tenere i piatti sul ghiaccio.
3. Eutanasia topi con CO _2.
4. Del mouse sulla superficie protetta dissezione, lato ventrale rivolto verso l'alto. Mouse spruzzo con 70% etanolo per la sterilizzazione e per assicurare che il pelo è arruffati giù.
5. Usando forbici c....

Results

In fisiologiche TCR modelli transgenici e topi WT, selezione positiva inizia nella fase DP ^luminoso prima di passare alla fase di DP ^opaca dopo l'incontro di antigene. Timociti DP ^opaco quindi inserire una transizione CD4 ⁺ CD8 ^lo stadio prima di diventare CD4SP o timociti CD8SP (Figura 2B). Timociti maturi SP sono caratterizzati da elevata espressione TCR e perdita di CD24 (Figura 2C). Mentre il CD8 da CD4 profilo può rivelare dife.......

Discussion

Il protocollo qui presentato può essere utilizzato per esaminare selezione positiva e negativa in non-transgenici TCR e TCR topi transgenici. Questo protocollo descrive la colorazione degli antigeni di superficie. Per un'ulteriore analisi dei meccanismi molecolari, è spesso necessario eseguire la colorazione intracellulare. Usiamo il BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit per la maggior parte delle proteine ​​intracellulari e la Foxp3 BD Biosciences Kit di colorazione per fattori di trascrizione. Noi di solito acquis.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Sale HyClone Hank soluzione equilibrata	Thermo Scientific	SH30030.02
Rete metallica schermi	Cedarlane	CX-0080-E-01
Piastre di Petri (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	877221
Siringhe (3 ml)	BD Biosciences	309657
Provette coniche (15 ml)	Sarstedt	62.554.205
Microscopio	Zeiss - Primo Star	415500-00XX-000
Emocitometro	HausserScientifico	3110
Piastra a 96 pozzetti	Sarstedt	82.1582.001
Pipetta multicanale	FISHERBRAND	21-377-829
Siero fetale di vitello	PAA	A15-701
Tampone fosfato salino	Fisher Scientific	SH3025802
Sodio azide	IT Baker Chemical Co.	V015-05
FcR reagente bloccante			Clone 2.4G2
Anti-mouse HY TCR	eBioscience	XX-9930-AA *	Clone T3.70
Anti-topo CD4	eBioscience	XX-0042-AA *	Clone RM4-5
Lanti-mouse CD8α	eBioscience	XX-0081-AA *	Clone 53-6,7
Anti-topo CD24	eBioscience	XX-0242-AA *	Clone M1/69
Anti-mouse TCRβ	eBioscience	XX-5961-AA *	Clone H57-597
Anti-topo CD69 Biotinylated	eBioscience	13-0691-AA *	Clone H1.2F3
Anti-mouse CD5 Biotinylated	eBioscience	13-0051-AA *	Clone 53-7,3
Streptavidina	eBioscience	XX-4217-AA *
Citometro di flusso	BD Biosciences - FACS Canto	338962
FACS tubi	BD Biosciences	352052
Citometria di flusso software di analisi	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640	Thermo Scientific	SH30027.01
			* Varia da XX e YY fluorocromo varia per grandezza flaconcino.