Questo articolo e il video di accompagnamento presentare il nostro protocollo per la generazione di tessuto ingegnerizzato intestino nel topo, utilizzando un organoid unità-on-scaffold approccio.
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Articolo metodologico
L'ingegneria dei tessuti del colon in un modello murino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dell'ingegneria tissutale piccolo intestino (TESI) è stato utilizzato con successo per salvare i ratti Lewis dopo massiccia resezione dell'intestino tenue, con conseguente ritorno al peso pre-operatorie entro 40 giorni. 1 negli esseri umani, massiccia resezione del piccolo intestino può causare sindrome da intestino corto, un malassorbimento funzionale stato che conferisce una significativa morbidità, mortalità e costi sanitari tra cui la dipendenza nutrizione parenterale, insufficienza epatica e cirrosi, e la necessità di trapianti di organi multiviscerale. 2 In questo lavoro si descrivono e documentano il nostro protocollo per la creazione di tessuti ingegnerizzati intestino in un modello murino con una unità multicellulare organoid-on-scaffold approccio. Unità Organoid sono aggregati multicellulari derivanti dall'intestino che contengono elementi sia delle mucose e mesenchimali, 3 il rapporto tra che conserva l'intestinale nicchia delle cellule staminali. 4 Nella ricerca in corso e future, la transizione della nostra tecnica nelladel mouse consentirà di indagine dei processi che intervengono durante la formazione TESI utilizzando gli strumenti disponibili transgeniche in questa specie. 5 La disponibilità di ceppi di topi immunocompromessi inoltre ci permette di applicare la tecnica di tessuto intestinale umano e ottimizzare la formazione di TESI umana come xenotrapianto del mouse prima della sua transizione verso gli esseri umani. Il nostro metodo utilizza le buone prassi di fabbricazione (GMP) reagenti e materiali che sono già stati approvati per l'uso in pazienti umani, e offre quindi un vantaggio significativo rispetto agli approcci che si basano su tessuti animali decellularizzato. L'obiettivo finale di questo metodo è la sua traduzione per gli esseri umani come una strategia di medicina rigenerativa terapeutico per la sindrome dell'intestino corto.
Protocollo
1. Organoid unità di preparazione
- Strumenti adeguati per la dissezione del mouse (forbici e pinze) devono essere sterilizzati in autoclave.
- Umanamente eutanasia il mouse donatore secondo protocolli locali IACUC. Assicurarsi che l'animale è morto prima di procedere.
- Fare una incisione mediana per accedere alla cavità peritoneale. Lembi cutanei può essere riflessa come necessario per migliorare l'esposizione.
- Sventrare il piccolo intestino e dividerlo appena distalmente al legamento di Treitz. Separare il piccolo intestino dal suo mesentere con tagliente e dolce smussa. Identificare la giunzione ileocecale e dividere il ....
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Risultati
La figura 1 mostra uno schema generale per il protocollo qui documentato. Il risultato finale di questo protocollo è una struttura sferica del globo o tissutale intestino murino con un lume, mucosa, sottomucosa, muscolare e circostante. Figura 2A mostra un globo tipico rispetto ad un polimero di partenza patibolo. Figura 2B mostra lo stesso costrutto bruscamente bivalved di rivelare le sue lumen. Figura 3 illustra un ematossilina / eosina-stained paraff.......
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Discussione
Vi presentiamo un protocollo per la produzione di tessuti ingegnerizzati intestino nel topo utilizzando un unità-on-scaffold approccio organoid. Le fasi più critiche sono quelle della preparazione organoid unità. Bisogna fare attenzione a pulire in modo adeguato e meccanicamente elaborare il tessuto, ma la stessa cura deve essere presa per non overdigest o overtriturate le unità organoid dopo la digestione viene eseguita (passo 1.11). Se questo è fatto, le unità organoid può essere ridotto a singole cellule, che possono.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel, e Frédéric G. Sala sono supportati dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM), i numeri di concedere RN2-00946-1 (TCG) e TG2-01168 (ERB, FGS). Allison L. Speer è una Società di Chirurgia dell'Università Ethicon studioso. Yashuhiro Torashima è finanziato da un ospedale pediatrico Fellowship Los Angeles Saban Research Career Development Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotico-antimicotica 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispasi | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenasi tipo 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM glucosio Alta 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Di calore FBS inattivato | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | Per la preparazione del polimero, come in rif.4 |
| Poli-L-lattico | Durect | B6002-1 | Per la preparazione del polimero, come in rif. 4 |
| Collagene di tipo I, coda di topo | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Per la preparazione del polimero, come in rif. 4 |
| Ketoprofene 100 mg / ml | Fort Dodge Animal Health | 71-cheto-100-50 | |
| LabDiet 5001 roditore chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurano, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
Riferimenti
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem....
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Ristampe e permessi
