Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

Sommario

I progressi nella spettrometria di massa hanno permesso l'analisi ad alta velocità di espressione della proteina e la modifica in una miriade di tessuti. In combinazione con frazionamento subcellulare e modelli di malattia, di massa quantitativa spettrometria e bioinformatica può rivelare nuove proprietà nei sistemi biologici. Il metodo qui descritto analizza cromatina proteine ​​associate alla regolazione di malattie cardiache ed è facilmente applicabile ad altre In vivo Modelli di malattie umane.

Abstract

Nel nucleo risiedono le proteomi le cui funzioni sono più intimamente collegati con regolazione genica. Adulto nuclei cardiomiociti mammiferi sono unici a causa della elevata percentuale di cellule binucleated, ¹ lo stato prevalentemente eterocromatico del DNA, e la non divisione natura del cardiomiociti che rende nuclei adulto in uno stato permanente di interfase. ² Regolazione trascrizionale durante lo sviluppo e la malattia sono stati ben studiati in questo organo, ^3-5 ma ciò che rimane relativamente inesplorato è il ruolo svolto dalle proteine ​​nucleari responsabili per il confezionamento del DNA e di espressione, e di come queste proteine ​​controllare i cambiamenti nei programmi trascrizionali che si verificano durante la malattia. ⁶ Nella sviluppato mondo, la malattia di cuore è la causa numero uno di mortalità sia per gli uomini e le donne. ⁷ Insight su come proteine ​​nucleari cooperano per regolare la progressione di questa malattia è fondamentale per far progredire l'attuale trattamento opzioni.

La spettrometria di massa è lo strumento ideale per affrontare queste domande in quanto permette una annotazione imparziale della quantificazione nucleare proteoma e relativo per come l'abbondanza di queste proteine ​​cambiamenti con la malattia. Mentre ci sono stati diversi studi di proteomica per mammiferi complessi proteici nucleari, ^8-13 fino a poco tempo ¹⁴ vi è stato un solo studio che esamina la proteoma cardiaco nucleare, ed è considerato il nucleo intero, piuttosto che esplorare il proteoma a livello di compartimenti sub nucleari . ¹⁵ In gran parte, questa carenza di lavoro è dovuta alla difficoltà di isolare nuclei cardiaca. Nuclei cardiaca avvenire entro un rigido e denso actina-miosina dell'apparecchio a cui sono collegati tramite estensioni multiple dal reticolo endoplasmatico, nella misura in cui altera contrazione miociti loro forma complessiva. ¹⁶ Inoltre, cardiomiociti sono il 40% in volume mitocondri ¹⁷ che necessitates arricchimento del nucleo parte le altri organelli. Qui si descrive un protocollo per cardiaca arricchimento nucleare e ulteriore frazionamento in compartimenti biologicamente rilevanti. Inoltre, i metodi di dettaglio per l'etichetta senza dissezione massa quantitativa spettrometria di queste frazioni-tecniche suscettibili di sperimentazione in vivo in vari modelli animali e sistemi di organi in cui marcatura metabolica non è fattibile.

Protocollo

Il flusso di lavoro sperimentale contiene sette fasi principali (Figura 1). Per ogni lavoro che coinvolge i campioni che verranno eseguiti sul spettrometro di massa, lo sperimentatore deve indossare un camice da laboratorio, guanti e retina per capelli e fare attenzione per evitare la contaminazione da polvere e spargimento personale di cheratina.

1. Cuore Omogeneizzazione e isolamento nucleare

Cuore di topo sono omogeneizzare e una intatta nuclei pellet è isolato (Figura 2).

1. Sacrificio topo adulto, accisa il cuore, sciacquare in ghiaccio PBS freddo, e omogeneizzare....

Risultati

Figura 4 mette in evidenza l'utilità di questa forma di quantificazione relativa. Mostrata nel pannello di sinistra sono i singoli picchi peptide monoisotopico (sovrapposto da diversi tipi di mouse), che sono state designate come appartenenti alla proteina HMGB1 (identificato tramite ricerca nel database). Ogni picco, essenzialmente un cromatografo ionico estratta per il dato peptide, proviene da un mouse diverso. I gruppi rappresentano tre diversi stati fisiologici: basale, l'ipertrofia cardiac.......

Discussione

Due metodi principali per isolamento nucleare sono stati esaminati in precedenza: ²⁷ uno è la tecnica di omogeneizzazione Behrens tessuto liofilizzato in un solvente non acquoso e la seconda, una modifica che usiamo qui, omogeneizzazione di tessuto in una soluzione acquosa di saccarosio / soluzione salina seguita dal differenziale o centrifugazione in gradiente di densità.

Subfractionation dei nuclei mediante estrazione acido su campioni di tessuto è uno strumento importante per l.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Dulbeco Eagle modificato Media	Invitrogen	11965
Proteasi pellet	Roche	04 693 159 001
100 um filtro	BD Falcon	352360
Ultracut ultramicrotomo	Reichert
100CX elettronica a trasmissione Microscopio	JEOL USA, Inc.
Rigogolo	BioRad	161-0496
Istone H2A anticorpo	Santa Cruz	sc-8648
Nucleoporin anticorpo p62	BD Biosciences	610498
Adenina nucleomarea trasportatore anticorpo	Santa Cruz	sc-9299
BiP anticorpo	Santa Cruz	sc-1050
Tubulina	Sigma	T1568
Istone H3 anticorpo	Abcam	ab1791
Fibrillarina anticorpo	Segnalazione cellulare	C12C3
SNRP70 anticorpo	Abcam	ab51266
E2F-1 anticorpo	Thermo Fisher	MS-879
Retinoblastoma anticorpo	BD Biosciences	554136
Ipossia inducibile fattore-1 anticorpo	Novus Biologicals	NB100-469
BCA proteina test	Thermo Scientific	23227
Colonna a fase inversa	Obj Nuovocace	PFC7515-B14-10
Bioworks Browser	Thermo Scientific