Allevamento e iniezione di<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Le larve per valutare virulenza batterica

Elizabeth Hussa; Heidi Goodrich-Blair

doi:10.3791/4295

Sommario

Il metodo qui descritto utilizza l'iniezione diretta di batteri entomopatogeni nella hemocoel di Manduca sexta Larve di insetti. M. Sexta È un insetto disponibile in commercio e ben studiata. Quindi, questo metodo rappresenta un approccio semplice per analizzare interazioni host-batteriche dalla prospettiva di uno o entrambi i partner.

Abstract

Manduca sexta, comunemente noto come il hornworm tabacco, è considerato un parassita agricolo significativo, nutrendosi di piante solanacee tra cui tabacco e pomodoro. La suscettibilità di M. larve sexta ad una varietà di specie di batteri entomopatogeni ^1-5, così come la ricchezza di informazioni disponibili riguardo al sistema immunitario dell'insetto ^6-8, e la sequenza del genoma in attesa di ⁹ ne fanno un organismo buon modello per l'uso in studio delle interazioni ospite-microbo durante la patogenesi. Inoltre, M. larve sexta sono relativamente grandi e facili da manipolare e mantenere nel relativo laboratorio per altre specie sensibili insetti. Loro grandi dimensioni facilita anche efficiente tessuto / emolinfa estrazione per analisi della risposta dell'ospite all'infezione.

Il metodo qui presentato descrive l'iniezione diretta di batteri nella hemocoel (cavità sangue) di M. Sexta larve. Questo approcciopuò essere utilizzato per analizzare e confrontare le caratteristiche di virulenza di varie specie batteriche, ceppi mutanti, o semplicemente controllare il tempo di morte insetto dopo l'iniezione. Questo metodo è stato sviluppato per studiare la patogenicità di Xenorhabdus e specie Photorhabdus che associano di norma con i vettori di nematodi come mezzo per entrare in l'insetto. Nematodi entomopatogeni in genere infettano le larve tramite digestivo naturale o aperture respiratorie, e di rilasciare il loro contenuto simbiotici batteriche nella emolinfa insetto (sangue) poco dopo ^10. Il metodo descritto qui di iniezione evita il bisogno di un vettore nematode, quindi sganciare gli effetti dei batteri e nematodi sul insetto. Questo metodo permette di conteggio accurato del materiale infetto (cellule o proteine) entro l'inoculo, che non è possibile utilizzare altri metodi esistenti per analizzare entomopathogenesis, compresi nick ¹¹ e saggi di tossicità orale ¹² L'utilità del metodo di iniezione diretta, come descritto qui è analizzare patogenesi batterica monitorando mortalità insetto. Tuttavia, questo metodo può essere facilmente espanso per uso a studiare gli effetti di infezione sul M. sexta sistema immunitario. L'insetto risponde alle infezioni tramite sia le risposte umorali e cellulari. La risposta umorale comprende il riconoscimento di batteri associati modelli e conseguente produzione di vari peptidi antimicrobici ^7, l'espressione di geni che codificano questi peptidi possono essere monitorati dopo infezione diretta tramite estrazione di RNA e PCR quantitativa ^13. La risposta cellulare di infezione coinvolge nodulazione, incapsulamento, e fagocitosi di agenti infettivi attraverso emociti ⁶ 13, 14.