Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

Summary

Per studiare il mutualismo tra Xenorhabdus Batteri e Steinernema, i metodi sono stati sviluppati per monitorare la presenza di batteri e posizione all'interno nematodi. L'approccio sperimentale, che può essere applicata ad altri sistemi, comporta batteri ingegneria per esprimere la proteina fluorescente verde e visualizzazione, utilizzando batteri microscopia a fluorescenza all'interno del nematode trasparente.

Abstract

Simbiosi, la convivenza di due o più organismi, sono diffusi in tutti i regni della vita. Come due dei microrganismi più diffusi sulla terra, nematodi e batteri formano una vasta gamma di associazioni simbiotiche che vanno dal vantaggioso per patogeni ^1-3. Una tale associazione è il rapporto di reciproco beneficio tra i batteri e nematodi Xenorhabdus Steinernema, che è emerso come un sistema modello di simbiosi ^4. Nematodi Steinernema sono entomopatogeno, usando il loro simbionte batterico per uccidere gli insetti ^5. Per la trasmissione tra gli host di insetti, i batteri colonizzano l'intestino dello stadio infettivo del nematode del giovanile ^6-8. Recentemente, diverse specie di nematodi altri hanno dimostrato di utilizzare i batteri per uccidere insetti ^9-13, ed indagini hanno iniziato a esaminare le interazioni tra i nematodi e batteri in questi sistemi <sup> 9.

Si descrive un metodo per la visualizzazione di un simbionte batterico all'interno o su un host nematode, sfruttando la trasparenza ottica di nematodi quando visti al microscopio. I batteri sono progettati per esprimere una proteina fluorescente, consentendo loro visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza. Sono disponibili molti plasmidi che portano geni che codificano proteine ​​che reagiscono a lunghezze d'onda differenti (verde o rossa), e la coniugazione dei plasmidi da un ceppo di Escherichia coli in un donatore simbionte destinatario batterica è successo per una vasta gamma di batteri. I metodi descritti sono stati sviluppati per indagare l'associazione tra Steinernema carpocapsae e Xenorhabdus nematophila ^14. Metodi simili sono stati utilizzati per studiare altri nematodi batterio associazioni ^{9, 15-18} e l'approccio è quindi generalmente applicabile.

La method consente la caratterizzazione della presenza di batteri e localizzazione all'interno nematodi a diversi stadi di sviluppo, fornendo approfondimenti sulla natura dell'associazione e il processo di colonizzazione ^{14, 16, 19.} Analisi microscopica rivela sia colonizzazione frequenza all'interno di una popolazione di batteri e localizzazione per ospitare tessuti ^{14, 16, 19-21.} Questo è un vantaggio rispetto ad altri metodi di monitoraggio batteri all'interno popolazioni di nematodi, come sonicazione ²² o molatura ^23, che possono fornire livelli medi di colonizzazione, ma non può, per esempio, discriminare popolazioni con una frequenza elevata di bassi carichi simbionti da popolazioni con una bassa frequenza di carichi elevati simbionti. La discriminazione della frequenza e del carico di batteri colonizzatori può essere particolarmente importante quando lo screening o la caratterizzazione di mutanti batterici fenotipi colonizzazione ^{21, 24.} Infatti, microscopia a fluorescenza è stato utilizzato in screening ad alta di mutanti batterici per difetti di colonizzazione ^{17, 18,} ​​ed è meno laborioso rispetto ad altri metodi, compreso sonicazione ^{22, 25-27} e dissezione nematode individuale ^{28, 29.}

Protocol

1. Costruzione di un ceppo batterico fluorescente via Coniugazione

1. Crescere il ceppo ricevente (simbionte da esaminare) e ceppo donatore overnight. Il ceppo donatore, di solito Escherichia coli, dovrebbe essere in grado di donare DNA tramite coniugazione e devono essere trasformati con un plasmide (Tabella 2) che porta un gene codificante una proteina fluorescente. A seconda del plasmide, un ceppo helper coniugazione può anche essere richiesto. Se è così, questo ceppo deve anche essere coltivate durante la notte. Il ceppo donatore e ceppo helper dovrebbero essere coltivate con antibiotici per selezionare per il mantenimento del pl....

Discussion

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per la rilevazione ottica di batteri all'interno di un host nematode (Figura 1). Questo metodo sfrutta la trasparenza ottica di nematodi e la capacità di etichetta fluorescente batteri, consentendo l'analisi in vivo di batteri all'interno dell'ospite nematode (Figura 3). In particolare, questo approccio identifica localizzazione batterica all'interno del suo ospite. Contando una popolazione di nematodi e scoring.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Lipid Agar (Sterile)			8 grammi di brodo di coltura, 15 grammi di agar, 5 grammi di estratto di lievito, 890 ml di acqua, 10 ml 0,2 g / ml MgCl2. 6H 2 0, 96 ml di sciroppo di mais soluzione *, 4 ml di olio di mais * Mescolare i media versando piastre * Aggiungere ingrediente sterile dopo la sterilizzazione in autoclave
Mais Sciroppo Soluzione (Sterile)			7 ml di sciroppo di mais, 89 ml di acqua mix e autoclave
Egg Solution			16,6 ml di ipoclorito di sodio al 12%, 5 ml KOH 5M, 80 ml di acqua
Lisogenia Brodo (Sterile)			5 grammi di estratto di lievito, 10 triptone grammi, 5 grammi di sale, 1 litro di acqua mix e autoclave
Microcentrifugare	Pescatore	13-100-675	Qualsiasi microcentrifuga che contiene i tubi microcentrifuga funziona
Centrifuga	Beckman	366802	Dimensioni piano centrifuga tabella che contiene 15 ml e 50 ml provette coniche
Sterile 60 mm x 15 millimetri Petri	Pescatore	0875713
50 ml per centrifuga tubi	Pescatore	05-539-6
15 ml per centrifuga tubi	Pescatore	05-531-6
Sterile 100 millimetri x 20 mm Petri	Pescatore	0875711Z	Più profondo rispetto ai normali piastre di Petri
24-pozzetti	Greiner Bio-One	662000-06
Microscopio			Il microscopio ha bisogno di capacità fluorescenti compatibile con il fluoroforo
Paraformaldeide	Scienze della microscopia elettronica	15710
PBS (Sterile)			8 g NaCl 0,2 g KCL 1,44 g di Na 2 HPO 4 0,24 g KH 2 PO 4 1 L di acqua Un pH di 7,4 e acqua a 1 L e autoclave
Provette per microcentrifuga	Pescatore	05-408-138	2 ml o 1.5 ml tubi
Shaker			Qualsiasi shaker che fa sì che il liquido per spostare delicatamente funziona
Acido Diaminopimelic	Sigma	D-1377	Se necessario, integrare i media ad una concentrazione o 1 mM