Gli effetti di attivazione di proteina chinasi C (PKC) isoenzimi sulle funzioni mitocondriali associate respirazione e fosforilazione ossidativa e sulla vitalità cellulare sono descritti. L'approccio si adatta tecnica adenovirale per sovraesprimere selettivamente isoenzimi PKC in coltura primaria e una varietà di saggi per determinare le funzioni mitocondriali e lo stato energetico della cellula.
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Articolo metodologico
La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi
In questo articolo
Sommario
Abstract
La proteina chinasi C (PKC) famiglia di isoenzimi è coinvolta in numerosi processi fisiologici e patologici. I nostri dati recenti dimostrano che la PKC regola la funzione mitocondriale e lo stato di energia cellulare. Numerosi rapporti hanno dimostrato che l'attivazione della PKC-a e PKC-ε migliora la funzione mitocondriale nel cuore ischemico e cardioprotettivo media. Al contrario, abbiamo dimostrato che PKC-α e ε-PKC sono coinvolte in nephrotoxicant indotta disfunzione mitocondriale e morte cellulare in cellule renali. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un modello in vitro di cellule renali mantenere attive le funzioni mitocondriali in cui isoenzimi PKC potrebbe essere selettivamente attivati o inibiti per determinare il loro ruolo nella regolazione della fosforilazione ossidativa e la sopravvivenza cellulare. Colture primarie di cellule renali del tubulo prossimale (RPTC) sono state coltivate in condizioni migliori con conseguente respirazione mitocondriale e l'attività di mitomitocondriale enzimi simili a quelli in RPTC in vivo. Poiché le tecniche di transfezione tradizionali (Lipofectamine, elettroporazione) sono inefficienti in colture primarie e avere effetti negativi sulla funzione mitocondriale, PKC-ε cDNA mutanti sono state consegnate ai RPTC attraverso vettori adenovirali. Questo approccio risulta in trasfezione di oltre il 90% RPTC colta.
Qui, vi presentiamo i metodi per valutare il ruolo della PKC-ε in: 1. regolazione della morfologia mitocondriale e funzioni associate alla sintesi di ATP, e 2. sopravvivenza della RPTC in coltura primaria. PKC-ε viene attivato overesprimono la costitutivamente attivo PKC-ε mutante. PKC-ε è inibita dalla sovraespressione della mutante inattivo di PKC-ε. Funzione mitocondriale viene valutata esaminando la respirazione, l'integrità della catena respiratoria, attività dei complessi respiratori e F 0 F 1-ATPasi, tasso di produzione di ATP, e il contenuto di ATP. La respirazione è unssessed in digitonina permeabilizzate RPTC come stato 3 (respirazione massima in presenza di substrati in eccesso e ADP) e respirazioni disaccoppiati. Integrità della catena respiratoria è valutata misurando attività di tutti e quattro complessi della catena respiratoria nei mitocondri isolati. Capacità di fosforilazione ossidativa viene valutata misurando il potenziale di membrana mitocondriale, tasso di produzione di ATP, e l'attività di F 0 F 1-ATPasi. Stato energetico del RPTC viene valutata determinando il contenuto intracellulare di ATP. Morfologia mitocondriale in cellule vive è visualizzato utilizzando MitoTracker Red 580, un colorante fluorescente che si accumula in particolare nei mitocondri, e monostrati vivi vengono esaminati al microscopio a fluorescenza. Vitalità RPTC è valutato in base annessina V / colorazione ioduro di propidio seguita mediante citometria di flusso per determinare apoptosi e oncosis.
Questi metodi consentono di attivazione selettiva / inibizione della PKC individuale isoenzimiper valutare il loro ruolo in funzioni cellulari in una varietà di condizioni fisiologiche e patologiche che possono essere riprodotti in vitro.
Protocollo
1. Isolamento dei tubuli prossimali renali per la cultura primaria
- Anestetizzare il coniglio, accise entrambi i reni e metterli in una piastra di Petri riempita con tampone di preparazione sterile (DMEM/F12 media) in una cappa a flusso laminare.
- Perfondere ogni rene con 50 ml di tampone prep seguiti da 50 ml di soluzione sterile salina tamponata con fosfato, pH 7,4 (PBS), e la soluzione di PBS-ossido di ferro (45 ml + 5 ml). De-capsulati reni e trasferirli al buffer di preparazione contenente deferoxamina.
- Harvest la corteccia di ciascun rene.
- Omogeneizzare il tessuto utilizzando un ml 15 Dounce omogeneizzatore. Versare l'....
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Risultati
La Figura 1 mostra che la consegna adenovirale di cDNA codificante le costitutivamente attivo (caPKC-ε) e inattivi (dnPKC-ε) mutanti di PKC-ε si traduce in livelli di proteine significativamente aumentati di PKC-ε in RPTC e nei mitocondri. Le cellule infettate con cDNA che porta il caPKC-ε vettore sovraespresso il fosforilata (attiva) sotto forma di PKC-ε mentre le cellule infettate con cDNA codificante dnPKC-ε overexpressed PKC-ε che è stato inattivo (non fosforilata) (Figura 1). La .......
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Discussione
L'approccio qui presentato consente di sovraespressione di isoenzimi singoli PKC nella coltura primaria di cellule del tubulo prossimale renale. Ci sono diversi punti di forza di questo approccio: 1. Permette di studiare meccanismi di regolazione in una popolazione omogenea di cellule (cellule del tubulo prossimale renale) che sono l'obiettivo primario per insulti vari (ischemia, ipossia, stress ossidativo), farmaci e nephrotoxicants all'interno del rene. 2. Funzioni mitocondriali in questo modello in vi.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health, Istituto Nazionale del Diabete e Malattie Digestive e Renali, 2R01DK59558 (a GN). MSNA Translational Research Institute sostenuto dal National Institutes of Health Centro Nazionale per la Ricerca Risorse concessione UL1 RR029884 fornito un finanziamento parziale per Core Citometria a Flusso di MSNA. Ringraziamo il Dott. Peipei Ping (Università di California a Los Angeles, Los Angeles, CA) per fornire un 'aliquota di adenovirus portare cDNA codificante il dominante negativo (inattivo) mutante della PKC-ε e il dottor Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywoo....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| Cappa a flusso laminare | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 | |
| 2 ml e 15 ml smerigliatrice Dounce tessuto | WHEATON | 989-24607, 357.544 | |
| 85 e 235 micron maglia di nylon | Piccole parti | CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD | |
| 50 ml provetta sterile | BIOLOGIX | BCT-P 50BS | |
| 1,5 ml micro tubo | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 35 x 10 mm piastre di coltura sterili | Corning | 430165 | |
| Jouan Centrifuga | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotori: Jouan T40 | |
| Regolabile micro-centrifuga | SIGMA | Modello 1-15 | |
| Monitor di ossigeno biologica | YSI Incorporated | YSI modello 5300A | |
| Singolo Ossigeno Sistema Camerale Micro | YSI Incorporated | 5356S | |
| Sonda di ossigeno | YSI Incorporated | 5331A | |
| Bagno di circolazione | YSI Incorporated | 5310 | |
| KCl e Kit membrana standard | YSI Incorporated | 5775 | |
| Agitatore magnetico | YSI Incorporated | 5222 | |
| Registratore Flatbed | Kipp & Zonen | BD 11E | |
| 48 pozzetti e piastre da 96 pozzetti trasparenti | Costar | 3548, 3679 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 | |
| Agitatore orbitale MaxQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 | |
| Spectra FLUOR Plus (assorbanza / fluorescenza / luminescenza lettore) | Tecan | F129005 | |
| Camicia d'acqua degli Stati Uniti Autoflow automatica di CO 2 incubatore | Nuaire | NU 4850 | |
| 12x75 mm in polistirolo Provette di coltura per citometria a flusso | Fisher Marca | 14-961-20 | |
| Axioskop Obiettivo a immersione in acqua 63x / 0,90 W | Carl Zeiss | 114846 Achroplan 44 00 67 | |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99-830 - PB | |
| DMEM / Ham F12 | Sigma | D 2906 - 1L | |
| Deferoxamina Mesylate | Hospira | D110 | |
| Collagenasi Tipo I | Worthington | 4196 | |
| Inibitore della tripsina | Sigma | T 6522 - 500mg | |
| 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1, 1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ioduro (JC-1) | Invitrogen | T3168 | |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 | |
| ATP bioluminescenza Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 | |
| Annessina V - FITC soluzione | BioVision | 1001 - 200 | |
| Citometro di flusso | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
Riferimenti
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorb....
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Ristampe e permessi
