La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

Sommario

Gli effetti di attivazione di proteina chinasi C (PKC) isoenzimi sulle funzioni mitocondriali associate respirazione e fosforilazione ossidativa e sulla vitalità cellulare sono descritti. L'approccio si adatta tecnica adenovirale per sovraesprimere selettivamente isoenzimi PKC in coltura primaria e una varietà di saggi per determinare le funzioni mitocondriali e lo stato energetico della cellula.

Abstract

La proteina chinasi C (PKC) famiglia di isoenzimi è coinvolta in numerosi processi fisiologici e patologici. I nostri dati recenti dimostrano che la PKC regola la funzione mitocondriale e lo stato di energia cellulare. Numerosi rapporti hanno dimostrato che l'attivazione della PKC-a e PKC-ε migliora la funzione mitocondriale nel cuore ischemico e cardioprotettivo media. Al contrario, abbiamo dimostrato che PKC-α e ε-PKC sono coinvolte in nephrotoxicant indotta disfunzione mitocondriale e morte cellulare in cellule renali. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un modello in vitro di cellule renali mantenere attive le funzioni mitocondriali in cui isoenzimi PKC potrebbe essere selettivamente attivati ​​o inibiti per determinare il loro ruolo nella regolazione della fosforilazione ossidativa e la sopravvivenza cellulare. Colture primarie di cellule renali del tubulo prossimale (RPTC) sono state coltivate in condizioni migliori con conseguente respirazione mitocondriale e l'attività di mitomitocondriale enzimi simili a quelli in RPTC in vivo. Poiché le tecniche di transfezione tradizionali (Lipofectamine, elettroporazione) sono inefficienti in colture primarie e avere effetti negativi sulla funzione mitocondriale, PKC-ε cDNA mutanti sono state consegnate ai RPTC attraverso vettori adenovirali. Questo approccio risulta in trasfezione di oltre il 90% RPTC colta.

Qui, vi presentiamo i metodi per valutare il ruolo della PKC-ε in: 1. regolazione della morfologia mitocondriale e funzioni associate alla sintesi di ATP, e 2. sopravvivenza della RPTC in coltura primaria. PKC-ε viene attivato overesprimono la costitutivamente attivo PKC-ε mutante. PKC-ε è inibita dalla sovraespressione della mutante inattivo di PKC-ε. Funzione mitocondriale viene valutata esaminando la respirazione, l'integrità della catena respiratoria, attività dei complessi respiratori e F ₀ F _1-ATPasi, tasso di produzione di ATP, e il contenuto di ATP. La respirazione è unssessed in digitonina permeabilizzate RPTC come stato 3 (respirazione massima in presenza di substrati in eccesso e ADP) e respirazioni disaccoppiati. Integrità della catena respiratoria è valutata misurando attività di tutti e quattro complessi della catena respiratoria nei mitocondri isolati. Capacità di fosforilazione ossidativa viene valutata misurando il potenziale di membrana mitocondriale, tasso di produzione di ATP, e l'attività di F ₀ F _1-ATPasi. Stato energetico del RPTC viene valutata determinando il contenuto intracellulare di ATP. Morfologia mitocondriale in cellule vive è visualizzato utilizzando MitoTracker Red 580, un colorante fluorescente che si accumula in particolare nei mitocondri, e monostrati vivi vengono esaminati al microscopio a fluorescenza. Vitalità RPTC è valutato in base annessina V / colorazione ioduro di propidio seguita mediante citometria di flusso per determinare apoptosi e oncosis.

Questi metodi consentono di attivazione selettiva / inibizione della PKC individuale isoenzimiper valutare il loro ruolo in funzioni cellulari in una varietà di condizioni fisiologiche e patologiche che possono essere riprodotti in vitro.

Protocollo

1. Isolamento dei tubuli prossimali renali per la cultura primaria

1. Anestetizzare il coniglio, accise entrambi i reni e metterli in una piastra di Petri riempita con tampone di preparazione sterile (DMEM/F12 media) in una cappa a flusso laminare.
2. Perfondere ogni rene con 50 ml di tampone prep seguiti da 50 ml di soluzione sterile salina tamponata con fosfato, pH 7,4 (PBS), e la soluzione di PBS-ossido di ferro (45 ml + 5 ml). De-capsulati reni e trasferirli al buffer di preparazione contenente deferoxamina.
3. Harvest la corteccia di ciascun rene.
4. Omogeneizzare il tessuto utilizzando un ml 15 Dounce omogeneizzatore. Versare l'....

Risultati

La Figura 1 mostra che la consegna adenovirale di cDNA codificante le costitutivamente attivo (caPKC-ε) e inattivi (dnPKC-ε) mutanti di PKC-ε si traduce in livelli di proteine ​​significativamente aumentati di PKC-ε in RPTC e nei mitocondri. Le cellule infettate con cDNA che porta il caPKC-ε vettore sovraespresso il fosforilata (attiva) sotto forma di PKC-ε mentre le cellule infettate con cDNA codificante dnPKC-ε overexpressed PKC-ε che è stato inattivo (non fosforilata) (Figura 1). La .......

Discussione

L'approccio qui presentato consente di sovraespressione di isoenzimi singoli PKC nella coltura primaria di cellule del tubulo prossimale renale. Ci sono diversi punti di forza di questo approccio: 1. Permette di studiare meccanismi di regolazione in una popolazione omogenea di cellule (cellule del tubulo prossimale renale) che sono l'obiettivo primario per insulti vari (ischemia, ipossia, stress ossidativo), farmaci e nephrotoxicants all'interno del rene. 2. Funzioni mitocondriali in questo modello in vi.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Cappa a flusso laminare	Thermo Electron Corporation	FORMA 1104
2 ml e 15 ml smerigliatrice Dounce tessuto	WHEATON	989-24607, 357.544
85 e 235 micron maglia di nylon	Piccole parti	CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
50 ml provetta sterile	BIOLOGIX	BCT-P 50BS
1,5 ml micro tubo	Sarstedt	72.690.001
35 x 10 mm piastre di coltura sterili	Corning	430165
Jouan Centrifuga	Jouan	Jouan CR3 11175704 Rotori: Jouan T40
Regolabile micro-centrifuga	SIGMA	Modello 1-15
Monitor di ossigeno biologica	YSI Incorporated	YSI modello 5300A
Singolo Ossigeno Sistema Camerale Micro	YSI Incorporated	5356S
Sonda di ossigeno	YSI Incorporated	5331A
Bagno di circolazione	YSI Incorporated	5310
KCl e Kit membrana standard	YSI Incorporated	5775
Agitatore magnetico	YSI Incorporated	5222
Registratore Flatbed	Kipp & Zonen	BD 11E
48 pozzetti e piastre da 96 pozzetti trasparenti	Costar	3548, 3679
Thermomixer R	Eppendorf	5355 21919
Agitatore orbitale MaxQ 2000	Thermo Scientific	SHKA 2000
Spectra FLUOR Plus (assorbanza / fluorescenza / luminescenza lettore)	Tecan	F129005
Camicia d'acqua degli Stati Uniti Autoflow automatica di CO 2 incubatore	Nuaire	NU 4850
12x75 mm in polistirolo Provette di coltura per citometria a flusso	Fisher Marca	14-961-20
Axioskop Obiettivo a immersione in acqua 63x / 0,90 W	Carl Zeiss	114846 Achroplan 44 00 67
DMEM / F12	Cellgro	99-830 - PB
DMEM / Ham F12	Sigma	D 2906 - 1L
Deferoxamina Mesylate	Hospira	D110
Collagenasi Tipo I	Worthington	4196
Inibitore della tripsina	Sigma	T 6522 - 500mg
5,5 ', 6,6'-tetracloro-1, 1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ioduro (JC-1)	Invitrogen	T3168
Mitotracker Red	Invitrogen	M22425
ATP bioluminescenza Assay Kit HS II	Roche	11 699 709 001
Annessina V - FITC soluzione	BioVision	1001 - 200
Citometro di flusso	BD Biosciences	BD FACSCalibur