Registrazione simultanea intracellulare di un motoneuroni lombare e la forza prodotta dal suo gruppo motore nel topo adulto In vivo

Sommario

Questo nuovo metodo permette la registrazione simultanea intracellulare di una motoneuron singolo topo adulto e la misura della forza prodotta dalle sue fibre muscolari. L'indagine combinato delle proprietà elettriche e meccaniche delle unità motorie negli animali normali e geneticamente modificato è una svolta per lo studio del sistema neuromuscolare.

Abstract

Il motoneurone spinale è da tempo un sistema di buon modello per studiare la funzione neurale perché è un neurone del sistema nervoso centrale con le proprietà uniche di (1) avente obiettivi facilmente identificabili (le fibre muscolari) e quindi con una funzione molto noto (per controllare contrazione muscolare), (2) essendo il bersaglio convergente di molte reti spinali e discendente, da cui il nome di "definitiva percorso comune", e (3) avente una grande soma che rende possibile penetrare con taglienti elettrodi intracellulari . Inoltre, quando studiata in vivo, è possibile registrare simultaneamente l'attività elettrica dei motoneuroni e la forza sviluppata dal loro obiettivi muscolari. Esecuzione di registrazioni intracellulari di motoneuroni in vivo quindi mettere il sperimentatore nella posizione unica di poter studiare, allo stesso tempo, tutti i comparti del "gruppo motore" (il nome dato al motoneurone, il suo assone, ele fibre muscolari che innerva ^1): gli ingressi che influiscono sul motoneurone, le proprietà elettrofisiologiche del motoneurone, e l'impatto di queste proprietà sulla funzione fisiologica dei motoneuroni, cioè la forza prodotta dal suo gruppo motore. Tuttavia, questo approccio è molto impegnativo, perché la preparazione non può essere paralizzato e quindi la stabilità meccanica per la registrazione intracellulare è ridotta. Pertanto, questo tipo di esperimenti è stato conseguito solo nei gatti e nei ratti. Tuttavia, lo studio dei sistemi spinali motore potrebbe fare un salto formidabile se era possibile effettuare esperimenti simili in topi normali e geneticamente modificati.

Per motivi tecnici, lo studio delle reti spinali nei topi è stata perlopiù limitata a neonatale in preparati in vitro, in cui i motoneuroni spinali e le reti sono immaturi, i neuroni motori sono separati dai loro obiettivi, e quando ha studiato a fette, il motoneurons sono separati dalla maggior parte dei loro ingressi. Fino a poco tempo, solo pochi gruppi erano riusciti a effettuare registrazioni intracellulari di motoneuroni in vivo ^2-4, compresa la nostra squadra che ha pubblicato un nuovo preparato che ci ha permesso di ottenere le registrazioni molto stabili di motoneuroni in vivo in topi adulti ^5,6. Tuttavia, queste registrazioni sono state ottenute in animali paralizzati, cioè senza la possibilità di registrare la forza di uscita di questi motoneuroni. Qui vi presentiamo una estensione di questa preparazione originale in cui siamo stati in grado di ottenere le registrazioni simultanee delle proprietà elettrofisiologiche dei motoneuroni e della forza sviluppata dal loro gruppo motore. Questo è un risultato importante, in quanto consente di identificare i diversi tipi di motoneuroni base al loro profilo di forza, e rivelando così la loro funzione. Accoppiato con modelli genetici disturbare circuito spinale segmentale ^7-9, o reproducting umana DiseÃse ^10,11, ci aspettiamo che questa tecnica sia uno strumento essenziale per lo studio del sistema motorio spinale.

Protocollo

1. Fase uno

Pre-anestetico farmaci: 10-15 minuti prima dell'induzione dell'anestesia, iniettare atropina (0,20 mg / kg) e methylprenidsolone (0,05 mg) sottocute per prevenire ipersalivazione ed edema, rispettivamente.

2. Fase due

Induzione di anestesia: iniettare sodio pentobarbital (70 mg / kg) o di una miscela di chetamina / xilazina (100 mg / kg e 10 mg / kg, rispettivamente) intra-peritoneale. Lasciate il mouse andare sotto fino a quando non reflex pizzico punta del piede può essere ottenuto. Se l'anestesia sembra troppo leggero, integrare con 1/4 della dose.

3. Fase tre

* Nota: questo tipo di chirurgia è una procedura terminale.

Quando un aereo chirurgico di anestesia è stato raggiunto, trasferire il mouse su una coperta calda sollevata in posizione prona.

1. Coprire il muso del topo con una maschera fornire puro O ₂ ad un flusso di 100 ml / min.
2. Utilizzo di un tagliatore di capelli, la barba la regione dorsale dalla nuca del collo alla base della coda.
3. Shave anche il diritto di arti posteriori.
4. Capovolgere il mouse in posizione supina, ma fare attenzione a lasciare la maschera per l'ossigeno sul posto.

4. Fase quattro

Fissare il mouse in posizione con suture occhiello attorno al arti e fissata ai quattro angoli della superficie di lavoro.

5. Fase cinque

Inserire una sonda di temperatura per monitorare la temperatura interna del mouse. Regolare coperta termica / potenza della lampada per mantenere la temperatura interna tra 36 ° C e 38 ° C.

6. Tracheotomia e la ventilazione artificiale

1. Utilizzando le forbici spuntate, fare un taglio sopra la trachea e tirare la pelle di distanza su entrambi i lati.
2. Utilizzando un forcipe smussato, lacerare la ghiandola salivare modo da esporre due muscoli sottili (sterno-ioideo) coprono la trachea.
3. Utilizzando pinze smussato, separare i due muscles lungo il loro separazione mediale per rivelare la trachea.
4. Utilizzando un 7 forcipe Dumont, far scorrere due lunghezze di 4,0 sutura di seta sotto la trachea.
5. Praticare un taglio trasversale nella trachea tra due anelli cartilaginei, ma fate attenzione a non completamente la sezione della trachea.
6. Inserire il tubo tracheale lungo la trachea, quindi fissarla su entrambi i lati dell'apertura di introduzione legando le suture sopra. Il tubo tracheale è collegata ad un ventilatore mouse (SAR-830/AP, CWE Inc.) e un capnografo (μcapstar, CWE Inc.). Il ventilatore è collegato, attraverso un sacchetto rispetto, ad una sorgente di pura O _2. Regolare i parametri del ventilatore (respirazione tasso di 100-150 bpm, il volume di fine espirazione 170-310 pl) in modo che il mouse non sta combattendo contro la ventilazione artificiale e di fine espirazione pCO ₂ è stabile tra il 4 e il 5%.

7. Posizionamento delle linee per via endovenosa

1. Usando le tecniche di dissezione smussa, esporre la giugularevena su un lato del collo. A questo livello, la vena giugulare si divide in due tronchi principali, le vene anteriori e posteriori per il viso.
2. Effettuare le seguenti operazioni per due volte, una serie per ciascuna di queste linee:
   1. Utilizzando Dumont 4 o 5 pinze, separare delicatamente la vena dal suo tessuto circostante congiuntivo.
   2. Utilizzando Dumont 7 pinze, far scorrere due lunghezze di 6,0 punti di sutura in seta sotto la vena. separarli per quanto possibile lungo la lunghezza della vena.
   3. Posizionare una clip piccola imbarcazione sul lato prossimale della vena (il lato più vicino al cuore), e legare il lato distale della vena.
   4. Utilizzo molto fine forbici iris, fare una piccola incisione trasversale nella vena, avendo cura di non grande sezione della vena completamente.
   5. Inserire preriempita catetere 1FR (premicath, Vygon) nell'apertura, fino al clip nave.
   6. Tenendo la vena e il catetere insieme in un 4 forcipe Dumont, rimuovere con attenzione la clip nave, quindi spingere il catetere una mor pochimillimetri posta nella vena.
   7. Fissare il catetere legandola con entrambe le suture su entrambi i lati l'inserimento.
3. Uno dei cateteri è collegato ad una siringa o una pompa a siringa per iniettare dosi supplementari di anestetici se necessario (solitamente ogni 10-30 min). La dose IV è o 6 mg / kg di sodio pentobarbital o 1250 40 mcg / kg / min di ketamina / xilazina ^12. L'altro catetere è collegato ad una pompa a siringa per infusione endovenosa lenta (50 microlitri / h) di una soluzione contenente glucosio 4% NaHCO ₃ (1%) e plasmion (14%).

8. Chiudere la pelle del collo con ago e sutura, e torna il mouse alla posizione prona

9. La dissezione del muscolo degli arti posteriori e Nervi

1. Con forbici, praticare un'incisione dalla cima della coscia al tendine di Achille. Separare la pelle dai muscoli sottostanti, facendo attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni. Cauterizzare come necessario.
2. Identifica il bordo anteriore del bicipite femorale, che appare come una linea bianca che corre lungo il coscia. Con forbici, aprire delicatamente lungo la linea dal ginocchio fino all'osso dell'anca. Separare i muscoli. Il nervo sciatico è ora visibile sotto il bicipite femorale.
3. Attenzione sezionare il bicipite femorale. Cauterize / legatura come necessario per prevenire le emorragie. Il bicipite femorale può essere completamente rimosso o semplicemente reclinata per esporre il nervo sciatico e il tricipite surale muscoli.
4. Staccare il nervo surale.
5. Utilizzo di 8/0 filo di seta, legare la parte distale del nervo peroneo comune e tagliare distale al nodo. Staccare il nervo tutta la strada fino, il più vicino al fianco il più possibile.
6. Identificare il nervo tibiale tra i nervi peroneo comune e Sural. Tra i diversi rami del nervo tibiale, individuare i rami che innervano il tricipite surale dai rami che vanno più profondo (d'ora in poi indicato come nervo tibiale).
7. Utilizzando 8/0 setafilo, legare insieme tutti i rami del nervo tibiale, mantenendo intatti i rami innervano il tricipite surale. Tagliare il nervo tibiale distalmente al nodo e sezionare il nervo up per quanto possibile.
8. Coprire l'intera hindlimb con una garza imbevuta con soluzione salina per evitare essiccazione mentre si procede con il passo successivo.

10. Laminectomia

1. Utilizzando le forbici, fare un'incisione lungo la spina dorsale. Separare la pelle dai muscoli sottostanti.
2. Fare due incisioni su ciascun lato delle vertebre per separare i muscoli sottocutanei. Quindi tagli ogni tendine dei muscoli che si attaccano sul lato delle vertebre su ogni lato.
3. Utilizzando pinze smussati e una curette fine, rimuovere il resto del muscolo sul lato dorsale delle vertebre intorno ai processi spinosi di identificare chiaramente ogni singola vertebra.
4. Identificare vertebre T13 e L1. T13 è l'ultima vertebra di avere nervature allegato. La colonna vertebrale will essere immobilizzato con i Spinal Cord morsetti vertebrali Cunningham (Stoelting Co.). Posizionare i morsetti spinali su ciascun lato del T13 e L1. Fare attenzione a non comprimere il midollo spinale, ma mettere un po 'di tensione lungo l'asse longitudinale. Verificare che la colonna vertebrale è ben protetto premendo delicatamente con una pinza.
5. Utilizzando rongeurs sottili, rimuovere i processi spinali poi le lamine sopra T13 e L1, esponendo così il midollo spinale.
6. Coprire il midollo spinale esposto con piccoli pezzi di cotone o spongel assorbito con soluzione fisiologica per prevenire l'essiccamento.
7. Inserire un costume da bagno in plastica sulla parte superiore della schiena, che circonda il midollo spinale. Fissare il bagno in posizione con 4/0 filo di seta. Assicurarsi che il bagno è impermeabile, sigillando con Kwik-Cast sigillante (WPI).
8. Una volta che il Kwik-Cast è asciugato, rimuovere il cotone che copre il midollo spinale, e riempire la vasca con olio minerale.
9. Utilizzando Dumont 5 pinze e molto sottili forbici iris, delicatamente tirare il compagno durar circonda il midollo spinale, e aprirlo quanto possibile in entrambe le direzioni. Piegare la dura su ciascun lato del midollo spinale.
10. Abbassare la piattaforma sollevata su cui il mouse viene disteso in modo da tenerla sospesa con il morsetto vertebrale.
11. Utilizzare un altro morsetto vertebrale per serrare un processo spinoso della regione sacrale di sostenere la regione posteriore dell'animale.
12. Un terzo morsetto viene usato per immobilizzare l'arti posteriori destro e caviglia, flesso a un angolo di 90 ° al ginocchio.

11. Del tendine di Achille Dissection

1. Con l'arto piegato a 90 ° al ginocchio e alla caviglia, rimuovere la garza che copre la zona degli arti posteriori, e sezionare il tendine di Achille libera dei tessuti circostanti. Sezionare il più possibile il tricipite surale dal tessuto circostante pure.
2. Tagliare il tendine del muscolo plantare vicino al calcagno, quindi tagliare nuovamente per rimuovere completamente il tendine.
3. Utilizzando un ago filettata, collegare 6/0 di seta filo attraverso °e tendine di Achille e fare un nodo triplo intorno al tendine.
4. Posizionare il trasduttore di forza vicino al nodo, tagliare la parte distale del tendine, e collegarlo al trasduttore di forza con il filo di seta.
5. Inserire due lunghezze di filo di acciaio inossidabile sotto la fascia dei muscoli tricipite surale. Questi fili sono collegati ad un amplificatore extracellulare AC per la registrazione EMG.
6. Posizionare il nervo peroneo comune e il nervo tibiale su due elettrodi bipolari gancio.
7. Posizionare il tricipite surale nervo sul catodo di un elettrodo gancio, con l'anodo toccando un muscolo vicina.
8. Collegare tutti gli elettrodi stimolanti ad una unità di isolamento.
9. Posizionare un elettrodo palla sulla superficie dorsale del midollo spinale, collegato ad un amplificatore extracellulare CA per registrare potenziali cordone dorso. Inserire un Ag / AgCl elettrodo di riferimento in contatto con un muscolo posteriore.

12. Passo Dodici

Stimolare il tricipite surale nervoutilizzando un impulso di 50 psec quadrato di crescente intensità a bassa frequenza (<1 Hz) fino a quando l'ampiezza massima contrazione si osserva. Spostare lentamente il trasduttore di forza di allungare il muscolo monitorando l'ampiezza della risposta neuromuscolare finché l'ampiezza contrazione raggiunge un massimo.

13. Registrazioni intracellulari dei motoneuroni

Da questo punto in poi, le tecniche standard elettrofisiologiche sono usati per preparare un elettrodo intracellulare, penetrare un neurone nel midollo spinale e identificare come motoneuroni.

1. Tirare una micropipetta di vetro a una punta ~ 1 micron utilizzando un estrattore pipetta (P-97 Micropipetta Puller, Strumenti Sutter). Riempire l'elettrodo con una soluzione di KCl 3M (resistenza dell'elettrodo 10-20 MW).
2. Utilizzando un micropositioner, guidare la micropipetta, collegato ad un amplificatore intracellulare (Axoclamp 2B, Axon Instruments) nel midollo spinale. Monitorare i potenziali di campo locali suscitate dalla stimolazione di each coraggio di individuare il parco macchine del tricipite surale.
3. Avvicinarsi con cautela motoneuroni putativi monitorando la resistenza del microelettrodo. Quando spinge contro una membrana, la resistenza aumenta. La penetrazione può a volte essere facilitata utilizzando la funzione "buzz" dell'amplificatore intracellulare.

14. Eutanasia Procedura

Alla fine dell'esperimento, l'animale è eutanasia da una overdose di pentobarbital (210 mg / kg IV), seguita da decapitazione.

Risultati

La figura 1 mostra come identificare un motoneuron dal gruppo tricipite surale dopo la penetrazione. A bassa intensità di stimolazione, solo una EPSP monosinaptico può osservare (Figura 1A). A maggiore intensità, l'EPSP potrebbe essere sufficiente per attivare un "ortodromica" spike (Figura 1B). A intensità di stimolazione ancora più in alto, un tutto-o-niente antidromica spike appare, con una latenza inferiore al EPSP monosinaptico (Figura 1C). Se abba...

Discussione

Il preparato qui descritto è il primo che permette, nel topo adulto, registrazione simultanea intracellulare di una motoneuron lombare e la misura della forza prodotta dalle fibre muscolari innervate dal suo assone.

A causa della piccola dimensione dell'animale, le capacità chirurgici necessari per questa preparazione può essere difficile da acquisire. Tuttavia, una volta che tali capacità sono padronanza, tutta la chirurgia può essere eseguita in tre ore, e gli animali possono sopravviv...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Atropina solfato	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Sodio pentobarbitone	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamina
Xylazina
Glucosio
Plasma Expander	Roger Bellon	Plasmagel
Forbici Blunt	FST	14079-10
Blunt forbici sottili	FST	15025-10
Vannas Primavera Forbici	FST	15002-08
Belle pinza dentata	FST	11370-32
Belle pinza dentata	FST	11370-31
Cunningham Adattatore spinale	Stoelting Co.
Kwik-Cast sigillante	WPI	# KWIK-CAST
Ventilatore	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnografo	CWE Inc	μcapstar
Riscaldamento coperta	Harvard Apparatus	507221F
Amplificatore intracellulare	Axon Instrumenti	Axoclamp 2B
Pipettare estrattore	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G