Un semplice protocollo per Clumping piastrinica mediata da Plasmodium falciparum infette in una risorsa Povero Setting

Summary

Questo metodo indaga la piastrinica mediata fenotipo aggregazione di Plasmodium falciparum-Infetti eritrociti (pRBC) in isolati clinici. Ciò avviene isolando e co-incubando plasma ricco di piastrine e una sospensione di pRBC.

Abstract

P. falciparum causa la maggior parte dei gravi infezioni malariche. I meccanismi fisiopatologici alla base malaria cerebrale (CM) non sono pienamente compresi e diverse ipotesi sono state avanzate, tra cui ostruzione meccanica dei microvasi di P. globuli rossi falciparum-parassitati (pRBC). Infatti, durante la fase intra-eritrocitaria del suo ciclo di vita, P. falciparum ha la capacità unica di modificare la superficie del eritrociti infetto esportando antigeni di superficie con diverse proprietà adesive sulla membrana RBC. Questo permette al sequestro di pRBC in molteplici tessuti e organi per adesione alle cellule endoteliali che rivestono il microcircolo delle venule post-capillari ^1. Così facendo, le forme mature del parassita evitano liquidazione splenica degli eritrociti infetti deformata ² e limitano il loro ambiente per una più favorevole bassa pressione di ossigeno ^3. Come conseguenza di questa SEQUESTrazione, è solo parassiti asessuati immaturi e gametociti che possono essere rilevati nel sangue periferico.

Cytoadherence e sequestro di pRBC maturo ai numerosi recettori ospitanti espressi su letti microvascolari si verifica nella malattia grave e senza complicazioni. Tuttavia, diverse linee di evidenza suggeriscono che solo fenotipi adesive specifiche sono suscettibili di essere associati con esiti patologici gravi di malaria. Un esempio di tali specifiche interazioni ospite-parassita è stata dimostrata in vitro, in cui la capacità della molecola di adesione intercellulare-1 per supportare legame di pRBC con particolari proprietà adesive è stato collegato allo sviluppo di malaria cerebrale ^4,5. La placenta è stato riconosciuto anche come sito preferenziale di accumulo pRBC nelle donne in gravidanza con infezione da malaria, con Chondrotin solfato Un espresso in sinciziotrofoblasti quella linea spazio intervilloso placentare come il principale recettore ^6. Rosette di pRBC teritrociti non infetti o attraverso il recettore del complemento a 1 (CD35) ^7,8 è stata anche associata con grave malattia ^9.

Uno dei più recentemente descritta P. falciparum fenotipi cytoadherence è la capacità del pRBC per formare grumi piastrinica in vitro mediata. La formazione di tali ciuffi pRBC richiede CD36, una glicoproteina espressa sulla superficie delle piastrine. Altro recettore umano, gC1qR/HABP1/p32, espressa su diversi tipi cellulari, comprese le cellule endoteliali e piastrine, è stato anche dimostrato per facilitare l'adesione pRBC su piastrine per formare grumi ^10. Se invece ciò avvenga in vivo è ancora chiaro, ma potrebbe spiegare la notevole accumulo di piastrine descritte nel microcircolo cerebrale dei bambini del Malawi che sono morti da cm ^11. Inoltre, la capacità del clinico di isolare le colture a raggrupparsi in vitro era direttamente legata alla gravità della malattia in Malawi ¹² 13, (anche se non in Mali ^14).

Con diversi aspetti del fenotipo aggregazione pRBC poco caratterizzato, studi in corso su questo argomento non hanno seguito una procedura standardizzata. Questo è un tema importante per la nota alta variabilità insita nel test ^15. Qui vi presentiamo un metodo per l'aggregazione piastrinica in vitro mediata da P. falciparum con la speranza che possa fornire una piattaforma per un metodo coerente per altri gruppi e aumentare la consapevolezza dei limiti di indagare questo fenotipo in studi futuri. Essendo basato in Malawi, forniamo un protocollo specifico per un ambiente risorsa limitata, con il vantaggio che gli isolati clinici di fresco raccolti possono essere esaminati per fenotipo senza necessità di crioconservazione.

Protocol

1. Raccolta dei campioni

Le piastrine possono essere facilmente attivati ​​tramite temperatura, agitazione o di stoccaggio e quindi dovrebbero essere maneggiati con cura. L'uso di vacutainer per raccogliere il sangue per la preparazione delle piastrine è inevitabile nella maggior parte delle situazioni cliniche, ma deve essere attentamente considerata come aspirazione può potenzialmente causare l'attivazione piastrinica. Grazie al protocollo clinico utilizzato presso il nostro ospedale di ricerca, i nostri campioni sono raccolti con cura in sodio citrato vacutainer. Non abbiamo avuto alcun problema con precoce attivazione piastrinica in questo o in un nostro precedente studio ^12. Raccogliamo il sangue per la preparazione delle piastrine dal gruppo sanguigno O + individui per ridurre al minimo non specifico gruppo sanguigno antigene aggregazione. I donatori non hanno assunto farmaci negli ultimi 7-10 giorni, come alcuni farmaci sono noti per influenzare la funzione piastrinica.

1.1 Preparazione di plasma ricco di piastrine (PRP)

1. Raccogliere circa 5 mldi sangue intero da una malaria ospite ingenui o 2,5 ml di sangue da CM o malaria grave (SM) pazienti in citrato di sodio vacutainer (BD codice prodotto 36276).
2. Centrifugare il sangue intero a 250 xg per 10 min a temperatura ambiente. Non centrifugare a 4 ° C a basse temperature possono causare le piastrine ad aggregarsi.
3. Trasferire con cautela il surnatante nuvoloso in un tubo pulito 15 ml. Piastrine sono facilmente attivata da variazioni di temperatura e agli urti fisici e dovrebbero pertanto essere maneggiato con cura. Evitare di scuotere o di eventuali movimenti a scatti del tubo.
4. Utilizzare haematocytometer di un Neubauer per contare e regolare la sospensione piastrinica> 300 x 10 ³ piastrine / mL per i donatori sani e <150 x 10 ³ piastrine / mL da CM e pazienti SM con 1X tampone fosfato (pH 7.2-7.4; PBS). Assicurati di scegliere un alto fattore di diluizione per facilitare la conta piastrinica e garantirne l'esattezza.

Nota: Malaria patients hanno una conta piastrinica ridotta rispetto ai soggetti sani ^16,17,18. Pertanto le concentrazioni di piastrine per CM e di messaggistica unificata vengono regolati secondo le conte medie piastrine per i pazienti all'interno di ogni gruppo di diagnosi della malaria. Il P. falciparum fenotipo aggregazione è comune negli isolati di CM e mostra una forte affinità di legame, pertanto le concentrazioni di piastrine ridotto non incide dimensione ciuffo o la frequenza in quanto la concentrazione di piastrine è standardizzato per tutti i casi CM.

1.2 Preparazione di plasma povero di piastrine (PPP)

1. Per ottenere PPP, centrifugare una porzione del PRP sopra ottenuto a 1500 xg per 10 min. La maggior parte delle piastrine sono pellettato sul fondo della provetta.
2. Sia il PRP e PPP possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di due settimane. Idealmente, utilizzare le piastrine fresche per il saggio di aggregazione. Dopo 8-10 giorni la maggior parte delle piastrine sono suscettibili di essere inattivo e probabilmente aggregato.

2. Parasite Cultura

1. Lavare i pellet pRBC tre volte con 5-10 ml RPMI 1640 per centrifugazione a 370 xg per 5 min.
   Nota: in questo protocollo di tutte le culture hanno iniziato da circa 1 ml ematocrito (PCV) e conservati al 5% di ematocrito. Le culture possono essere avviati con un PCV di pRBC e regolato di conseguenza, non infetto RBC e dei media per raggiungere ematocrito desiderato.
2. Posizionare il pRBC in un pallone cultura e supplemento con standard di coltura malaria di RPMI 1640 supplementato con HEPES 25 mm, 5% Albumax II o il 10% di siero e 40 mcg / ml di gentamicina per raggiungere un ematocrito 5%.
3. Permeato cultura palloni con una miscela del 92,5% di azoto, 2,5% di ossigeno e 5% di anidride carbonica prima di sigillare e incubando. In alternativa, può essere utilizzato il metodo di candela vaso a tenuta stagna di Trager-Jensen.
4. Per pRBC ottenuta direttamente dai pazienti, incubare loro pallone di coltura per 24-36 ore a 37 ° C in incubatore al 5% di CO ₂ per ottenere parassiti maturi.
   NOTA: Mlaboratorio ost e linee di cultura-adattati sono molto facili da mantenere in coltura in condizioni standard. Esistono tecniche semplici descritte di seguito che possono essere utilizzati per sincronizzare diversi stadi di parassiti di mantenere il tasso di crescita.
5. Preparare uno striscio di sangue sottile come descritto di seguito e di esaminare la maturazione parassita al microscopio ottico.

3. Thin Film sangue Preparazione del vetrino

1. Collocare circa 10-15 ml di sangue su una estremità di un vetrino di vetro smerigliato appoggiata su una superficie piana.
2. Toccare la goccia di sangue con il bordo di una seconda slitta finché il sangue sia uniforme il bordo della seconda slitta.
3. Mentre si tiene la seconda diapositiva a un angolo di 45 °, in modo rapido, ma con delicatezza, senza esercitare troppa pressione sulla prima diapositiva, fare scorrere il sangue in tutta la prima diapositiva di fare un film sottile di sangue che viene distribuito uniformemente. Aria secca.
4. Immergere il vetrino in metanolo per 10 sec. Aria secca.
5. Immergere il vetrino in 2% Giemsa stain per almeno 10 min. Sciacquare molto fino a quando l'acqua è pulita. Aria secca.
6. Esaminare diapositiva utilizzando un 90-100x lente emulsione di olio su un microscopio ottico

4. Purificazione e sincronizzazione delle fasi asessuate

La purificazione di una matura P. falciparum pRBC è un passo necessario per il saggio di aggregazione. Infatti, solo parassiti maturi sono in grado di legarsi ai recettori piastrinici come è in questa fase del ciclo di vita che i ligandi pertinenti sono espressi e sporgono dalla superficie degli eritrociti infetti. Ci sono diversi metodi per purificare e sincronizzare le fasi asessuali di P. falciparum: stadi asessuati tardivi possono essere arricchiti da Percoll gradiente ^19; cellula magnetica ordinamento ²⁰ o utilizzando il protocollo di gelatina di sedimentazione ²¹ qui descritto.. Sorbitolo-sincronizzazione seleziona per fasi anello ^22, dopo di che gli anelli sono coltivate per 24-26 ore per ottenere stadi maturi (senza need eseguire flottazione gelatina).

4.1 Plasmagel flottazione

Plasmagel galleggiamento usa soluzione di gelatina-come selezionare per peso inferiore knobbed eritrociti a rimanere in soluzione, mentre le forme ad anello dense e rosette si depositano sul fondo. Questa tecnica offre fino al 90% di purezza del maturo eritrociti stadio infette e può essere utilizzato sia per campo e isolati di laboratorio. Tuttavia, come accennato in precedenza, plasmagel galleggiamento rimuove pRBC rosette e stadi immaturi che potrebbe tradursi in una riduzione della frequenza di aggregazione nei campioni con una elevata frequenza di rosette. Tuttavia, l'assenza del pRBC rosette dopo plasmagel galleggiamento non influisce sul saggio di aggregazione perché rosette è un'interazione di eritrociti PRBC e non infetti, mentre aggregazione è pRBCs mediato vincolante dalle piastrine. Il ligando coinvolto in queste due caratteristiche è diverso, con il complemento principalmente recettore CR-1 su eritrociti non infetti mediazione rosette.

1. Soluzione Gelofusine Preriscaldare e siero / Albumax media II-libera a 37 ° C in un bagno d'acqua.
2. Trasferire la cultura ad un ambiente pulito sterile 15 ml di tubo e cellule pellet per centrifugazione a temperatura ambiente a 370 xg per 5 min.
3. Attenzione aspirare il surnatante in modo da non disturbare il pellet e risospendere le cellule in un volume uguale di Gelofusine medie e privo di proteine.
4. Trasferire miscela in una provetta sterile 15 ml e lasciare riposare per 15-20 minuti a 37 ° C incubatore o finché una chiara demarcazione rilevabile da un livello superiore e inferiore.
5. Trasferire con cautela lo strato superiore di un nuovo tubo sterile 15 ml e aggiungere 10 ml di RPMI fresca.
6. Centrifugare a 370 xg per 5 minuti e con attenzione scartare il surnatante.
7. Valutare fase parassitemia e di sviluppo da sottile striscio di sangue ed esaminare al microscopio ottico come descritto nella sezione 4.

NOTA: Mature gamma pRBC tra il 60-90% degli eritrociti infetti depending sul parassitemia iniziale della cultura. Per l'alta percentuale di parassiti maturi, utilizzare le culture con una parassitemia iniziale di ≥ 10%.

5. Aggregazione Assay

1. Utilizzare haematocytometer di un Neubauer per contare e regolare la sospensione pRBC ottenuto dopo flottazione plasmagel a 1 x 10 ⁸ pRBC / ml.
2. In una nuova provetta 1,5 ml, risospendere pRBC al 5% ematocrito, arancio acridina a 20 ug / ml concentrazione finale e PRP a 10% del volume totale.
   Invece di arancio di acridina, colture parassiti possono essere colorati con 25 ug / ml di bromuro di etidio per 5 minuti prima dell'uso.
   Ad esempio per un mix di reazione 200 microlitri, aggiungere 10 microlitri pRBC maturo, 20 l di 300 x 10 ³ piastrine / ml per PRP da donatori sani o 150 x 10 ³ piastrine / mL da pazienti SM e 170 ml di medio privo di proteine.
   NOTA: Il rapporto di piastrine: PRBC nelle reazioni finali è 20:1. Questo è importante in quanto si consente la massimaum frequenza aggregazione di un campione da determinare. Se un minor numero di piastrine vengono aggiunti nei controlli non poi tutti pRBCs clumping potrebbero avere la possibilità di ciuffo.
3. Nello stesso modo preparare i seguenti comandi; globuli rossi non infetti e PRP e pRBC con PPP per accertare il ruolo di piastrine nel pRBCs agglomerante.
4. Trasferire la sospensione in un flacone ml conica 1.5-2.0 coperchio a vite.
5. Porre la fiala sotto leggera agitazione per laminazione a 10-12 rpm a temperatura ambiente.
6. Verificare la presenza di formazione ciuffo da un wet-slide preparate: prelevare 10 ml di pRBC ± mix piastrinica su un vetrino, coprire con scivolare un bicchiere ed esaminare sotto fluorescenza.
7. Campionamento può essere fatto a intervalli di 15-20 min per un totale di 120 min. Un ciuffo è considerato come un aggregato di tre o più eritrociti infetti.

Results

Un esempio di un saggio ciuffo piastrine mediata utilizzando circa il 70% stadi maturi di P. falciparum dopo arricchimento da plasmagel flottazione è mostrato in Figura 2. Un ciuffo è un aggregato di tre o più eritrociti infetti. Colorazione con arancio di acridina o etidio bromuro può essere visualizzato mediante microscopia a fluorescenza. Arancio di acridina è spettralmente simile a fluoresceina, con un massimo di eccitazione a 502 nm e un massimo di emissione a 525 nm (verde), mentre etidio bromuro ha un massimo di eccitazione a 493 nm e un massimo di emissione a 620 nm (simile a tinture rodamina, rosso ). Ciuffi si individuano agevolmente al microscopio a luce normale come essi appaiono come aggregati di cellule e sotto fluorescenza come macchie di verde o rosso quando colorato con arancio di acridina o etidio bromuro coloranti, rispettivamente, come mostrato in Figura 2 (punto 30 tempo min utilizzando arancio di acridina ). Più grandi sono i grumi, il più grande aggregato cellulare appare ONUder normale luce e la più grande delle macchie di sotto verde o rosso fluorescenti per i rispettivi coloranti. Dal momento che l'obiettivo di coloranti DNA e quindi i nuclei macchia, piastrine e globuli rossi infetti non vengono rilevate al microscopio a fluorescenza a causa della loro mancanza di nuclei.

Formazione casuale di piccoli ciuffi PRBC di 4,7 ± 1,6 pRBCs / ciuffo si verificano dopo 30 min. La dimensione ciuffo aumenta significativamente a una media di> 15 PRBC / ciuffi dopo incubazione per 120 minuti con alcuni ciuffi contenenti numerosi pRBC / ciuffo che non poteva essere contato visivo. La frequenza del fenotipo agglomerante è calcolato come numero di cellule infette presenti in ciuffi / 1000 cellule infette, contati in saggi duplicati.

Figura 1. Il flusso di lavoro per l'aggregazione esperimento. Platelet rICH e plasma povero (A) e un P. cultura eritrociti falciparum infetto (B) vengono preparati e poi combinati per il saggio aggregazione (C).

Figura 2. Aggregazione di eritrociti infettati da P. laboratorio falciparum isolare. Ciuffi formate da HB3 al tempo 0, 30 e 120 minuti nel plasma ricco di piastrine (A) e scarsa ciuffo in plasma povero di piastrine (B).

Limitazioni del test

Ci sono limitazioni che incidono specificamente la funzione piastrinica o influenza il risultato e la maggior parte di questi sono già stati evidenziati da Arman e Rowe ^15. Qui citiamo alcuni dei potenziali problemi che si possono incontrare a different fasi del test:

1. Adattando isolati clinici di coltura in vitro può essere una sfida come talvolta lunghi periodi di coltura sono necessari per conseguire parassitemia alta abbastanza da permettere la formazione di grumi. Con alti tassi di variazione antigenica in P. falciparum, il fenotipo adesivo della cultura-adattato parassita potrebbe non rispecchiare l'originale popolazione infettando parassita dopo tempi prolungati in coltura.
2. Per evitare agglutinazione aspecifica causa antigeni dei gruppi sanguigni, donatori di piastrine devono corrispondere per l'antigene di gruppo sanguigno con isolati clinici utilizzati nello stesso saggio, o il donatore di gruppo sanguigno universale antigene O-utilizzata. Tuttavia, le persone con gruppo sanguigno O-sono rari in siti africani come il Malawi e quindi le piastrine comunemente utilizzati sono ottenuti da sangue di gruppo O + donatori e devono essere abbinati per gruppo sanguigno.
3. Contando ciuffi su una preparazione del vetrino bagnato è ingombrante e impegnativo per la cattura delle immagini, come la cells sono in costante movimento. Di solito, pRBC accumulano sui bordi del vetrino o tendono a stare insieme formando grumi "falsi" che possono essere facilmente confusi con ciuffi reali. Per ridurre movimento cella, consentire alle cellule sedimentare per 15 minuti a temperatura ambiente prima dell'analisi.
4. Il saggio di aggregazione è time-sensitive e quindi permette un solo campione da analizzare a persona alla volta per una precisione ottimale. Campionamento punti di tempo per due differenti campioni può facilmente sovrapporsi, causando non corrispondenti punti di tempo di campionamento tra campioni manipolzione più di un campione allo stesso tempo. In tali circostanze, un sofisticato software quantitativo potrebbe calcolare le dimensioni ciuffo o anticorpi in alternativa cellula-specifici potrebbe essere utilizzato per analizzare la composizione dei grumi. Mentre queste tecniche potrebbero migliorare notevolmente la significatività dei dati, in contesti poveri di risorse in cui questo test è suscettibile di essere utilizzato, tali tecniche e le attrezzature non sono facilmente disponibili.

Discussion

Abbiamo descritto un saggio aggregazione piastrinica mediata usato per studiare pRBC in isolati clinici direttamente in campo. Aggregazione piastrinica mediata, un comportamento caratteristico in P. isolati clinici falciparum, è stato identificato come un fenotipo distinto adesivo, frequenti negli isolati CD36 vincolanti ^12,23-24. Abbiamo usato questo test per identificare i tre punti principali: 1) una forte aggregazione in vitro fenotipo di P. falciparum isolato dai bambini del Malawi che è associato con la gravità della malattia e la diagnosi 2) nuovo recettore P-selectina mediaties clumping sulle piastrine insieme a CD36, 3) il grado di trombocitopenia presenti in pazienti con CM è sufficiente limitare l'ulteriore formazione di grumi PRBC in vitro ^12. Il coinvolgimento delle piastrine in formazione ciuffo è dimostrata esaminando una preparazione umido-slide come descritto nel capitolo 6. Le piastrine possono essere isolati da PRP per centrifugazione a velocità elevateal fine di minimizzare reazioni antigenici gruppi sanguigni, tuttavia, abbiamo utilizzato tutta PRP per minimizzare prematura attivazione piastrinica da movimenti eccessivi e dalla centrifugazione ad alta velocità. Attività delle piastrine può essere misurata mediante test di aggregazione piastrinica mediante deboli agonisti piastrinici, epinefrina o adenosina difosfato (ADP) ²⁵ come descritto in ^26.

Ci sono diversi aspetti del test che sono stati in precedenza scarsamente caratterizzati, uno dei quali è l'importanza di selezionare fonti PRP e l'effetto dei gruppi di antigeni del sangue sul risultato del test. Abbiamo preparato PRP da individui che erano il gruppo sanguigno O + e non aveva preso alcun farmaco negli ultimi 7-10 giorni prima che il sangue viene prelevato da alcuni farmaci possono influenzare il comportamento delle piastrine.

Altri fattori che possono influenzare la formazione di grumi di successo includono pRBC ematocrito, i livelli di parassitemia e la durata del test aggregazione. Utilizzando ematocrito alto e co piastriniciunt sarebbe difficile dire se il cluster è veramente un ciuffo o se troppe cellule sono semplicemente seduti insieme perché sono densamente ^15. Aggregazione anche generalmente aumenta con tempi di incubazione più lunghi. Questi sono tutti utili linee guida che devono essere considerati durante la progettazione di studi di grumi.

Troviamo che i campioni provenienti da diversi gruppi clinici possono essere analizzati in parallelo utilizzando PRP dallo stesso donatore se è possibile farlo, ma in contesti di risorse limitate, come i siti di campo la piscina trasfusione è generalmente limitato. È quindi difficile avere un singolo donatore O + per standardizzare i saggi. Abbiamo quindi identificato diverse O + donatori per garantire la compatibilità di gruppo sanguigno, ove possibile. L'utilizzo di più donatori è utile anche in caso di grandi campioni di dimensioni in modo tale onere della donazione di sangue non dovesse cadere in un solo individuo.

Punti di campionamento nei 15-20 minuti sono molto più fattibile se un singolo person sta conducendo le analisi, consentendo per i preparati wet-scivolo e l'esecuzione di analisi cinetica senza tempi di campionamento che si sovrappongono. Maggior parte dei dati microscopico è visivo e alquanto oggettivo, quindi, è importante che il conteggio delle cellule è verificato da più di una persona. In quel caso, la manipolazione di un campione alla volta può permettere un'analisi completa di tre-quattro campioni al giorno a seconda dell'efficienza personale.

Agglomerante piastrinica mediata può essere eseguita utilizzando sia clinici di laboratorio e isolati. Per le linee di laboratorio, si consiglia di CD36 parassiti vincolanti sono utilizzati per ottimizzare le frequenze grumi. Il dosaggio può essere accoppiato con altri test di agglutinazione quali rosette o utilizzato in saggi di inibizione aggregazione che consentano lo studio dei recettori sulle piastrine che possono mediare vincolante pRBC, un aspetto poco compreso ed esaminato di questo fenotipo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	21870-092
Acridina arancione	Invitrogen	A3568	10 mg/ml
Gelofusina	B Braun	Gelofusina
1 M HEPES	Invitrogen	15630
Gentamicina	Invitrogen	15750045	50 mg/ml
Albumax	GIBCO	1102-037
Vacutainer al citrato di sodio	BD	362760	Capacità 4 ml
Microscopio invertito	Leica	MD16000 B
Microscopio fluorescente	Leica	EL6000	Contiene filtri fluorescenti a luce blu e verde per l'arancio acridina e il bromuro di etidio