Un<em&gt; In Vitro</emPreparazione&gt; per stimolare e registrare i programmi motori Nutrire con i movimenti fisiologici in<em&gt; Aplysia californica</em

Sommario

Descriviamo una tecnica per la registrazione extracellulare e stimolare di nervi, muscoli e singoli neuroni identificati In vitro Mentre elicitare ed osservando diversi tipi di alimentazione comportamenti nell'apparato di alimentazione Aplysia.

Abstract

Multifunzionalità, la capacità di una struttura periferica per generare più comportamenti distinti, ^1, permette animali di adattarsi rapidamente loro comportamenti ai cambiamenti ambientali. Il mollusco marino Aplysia californica fornisce un sistema trattabili per lo studio della multifunzionalità. Durante l'alimentazione, Aplysia genera diversi tipi distinti di comportamenti con la stessa apparecchiatura di alimentazione, la massa buccale. I gangli che controllano questi comportamenti contengono una serie di grandi neuroni identificati che sono accessibili per lo studio elettrofisiologico. L'attività di questi neuroni è stato descritto in programmi motori che possono essere divisi in due tipi, programmi e ingestive egestive, basato sui tempi delle attività neurale che chiude la relativa grasper cibo all'attività neurale che protrae o indietro la pinza ^2. Tuttavia, in gangli isolato, i movimenti muscolari che producono tali comportamenti sono assenti, rendendodifficile essere certi se i programmi motori osservati sono correlati di comportamenti reali. In registrazioni vivo, nervose e muscolari sono stati ottenuti corrispondente a programmi di alimentazione ^2,3,4, ma è molto difficile registrare direttamente da singoli neuroni ^5. Inoltre, in vivo, programmi ingestive può essere ulteriormente suddiviso in morsi e ^1,2 rondini, una distinzione che è difficile fare in precedenza descritto più in preparati in vitro.

La preparazione massa sospesa buccale (Figura 1) colma il divario tra gangli isolati e animali intatti. In questa preparazione, comportamenti ingestive - compresi sia mordere e deglutizione - e comportamenti egestive (rifiuto) possono essere provocati, al tempo stesso neuroni individuali possono essere registrati da e stimolati con elettrodi extracellulari ^6. I movimenti di alimentazione associati a questi comportamenti differenti possono essere regiDED, quantificati e direttamente collegati ai programmi motori. I programmi del motore per la preparazione massa sospesa buccale sembrano essere più simili a quelle osservate in vivo che sono programmi motori suscitato nei gangli isolato. Pertanto, i programmi motori di questa preparazione può essere più direttamente collegate al comportamento in vivo, al tempo stesso, i singoli neuroni sono più accessibili a registrazione e stimolazione che in animali intatti. Inoltre, come fase intermedia tra gangli isolati e animali intatti, risultati della massa sospesa buccale può aiutare nella interpretazione dei dati ottenuti in ambienti sia più ridotte e più intatta. La preparazione massa sospesa buccale è uno strumento utile per caratterizzare il controllo neurale della multifunzionalità in Aplysia.

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni

1. Per preparare una soluzione di cloruro di magnesio che è isotonica di acqua di mare in cui sono tenuti gli animali (~ 1000 millosmolar), segnare una grande brocca al livello del volume desiderato. Riempire la caraffa con acqua distillata a circa l'80% di questo livello, e pesare la giusta quantità di cloruro di magnesio esaidrato per creare una soluzione 333 mM nel volume finale. Aggiungere il cloruro di magnesio per la brocca, chiudere il coperchio e agitare vigorosamente fino a che il cloruro di magnesio è completamente sciolto, quindi aggiungere acqua distillata fino al volume finale è raggiunto.
2. Per preparare salina Aplysia, nuovamente segnare una grande brocca al livello del volume desiderato, e riempire con acqua distillata a circa il 80% di questo livello. Posizionare la caraffa su un piatto mescolare, mettere un ancoretta nel boccale, e accendere il piatto mescolare.
3. Uno dopo l'altro, pesare e aggiungere la brocca per l'importo adeguato delle seguenti sostanze per creare questi concentrazioni nel volume finale: 460 mM cloruro di sodio, cloruro di potassio 10 mM, 22 mM di cloruro di magnesio esaidrato, 33 mM di solfato di magnesio eptaidrato, 10 mM di cloruro di calcio diidrato, 10 mM di glucosio, 10 mM MOPS.
4. Una volta che i soluti sono completamente sciolto, utilizzare un misuratore di pH per misurare il pH della soluzione. Lentamente aggiungere 1 M di idrossido di sodio per portare il pH ad un valore finale di 7,5. Se si aggiunge accidentalmente idrossido di sodio troppo, è possibile aggiungere 1 M di acido cloridrico per abbassare il pH.
5. Aggiungere acqua distillata fino al volume finale è raggiunta.
6. Per rallentare la crescita batterica, soluzioni di conservare in frigorifero fino al momento per un esperimento. Si noti che la temperatura può influire programmi motori Aplysia. Non monitorare con attenzione la temperatura, ma al termine dell'installazione, i preparativi sono in genere la temperatura ambiente vicino.

2. Preparazione del piatto di registrazione

1. Durante l'esperimento, la massa buccale saranno sospesi in soluzione inun tondo 100 mm (diametro) x 50 mm (altezza) pirofila. Questo piatto dovrebbe avere una camera anteriore per la massa buccale, una stretta piattaforma centrale sopraelevata in cui sono riposte gangli buccale sulla Sylgard, e un separato, camera posteriore elevata in cui è isolato il ganglio cerebrale. Una tacca nella Sylgard dovrebbe collegare la piattaforma buccale gangli alla camera ganglio cerebrale. Vedi Figura 1, facendo riferimento alle dimensioni specificate chiave nel costruire il piatto.
2. Per creare questo piatto, iniziare con un giro 100 x 50 millimetri piatto di pyrex. Preparare Sylgard seguendo le istruzioni fornite con il prodotto. Costruzione del piatto richiederà versa Sylgard diversi, tra cui il Sylgard deve essere permesso impostare.
3. La colata prima è creare il massimo livello di Sylgard nel piatto, la parete tra le camere buccali e cerebrale (vedere Figura 1). Bloccare questa porzione del piatto dalle altre sezioni. Plastilina può essere utilizzato per costruirepareti per bloccando le sezioni. Per una parete piana, un pezzo di cartone può essere utilizzato, con un supporto di plastilina. Per una parete curva (che riduce la dimensione della camera contenente il ganglio cerebrale), utilizzare plastilina solo come base per la parete. Rivestire le pareti di involucro di plastica dove potranno contattare la Sylgard per una più facile rimozione.
4. Una volta che lo spazio per la parete tra le camere buccali e cerebrale è stata bloccata come descritto in 2.3, assicurando la tenuta stagna ai bordi per minimizzare le perdite, versare Sylgard in questo spazio quasi fino alla parte superiore del piatto. Lasciare indurire Sylgard durante la notte, e assicurarsi che sia completamente impostata prima di continuare. Mettere il piatto in un luogo caldo indurrà più veloce impostazione.
5. Successivamente, la piattaforma gangli buccale e camera di ganglio cerebrale deve essere versato (di nuovo, fare riferimento alla figura 1, che mostra le posizioni di questi gangli nel piatto completata). Rimuovere le mura precedenti di blocco, e creare un nuovo muro di unposizione 0,5 cm dalla parete piana Sylgard della sezione centrale per bloccare la piattaforma buccale gangli. Non pareti sono necessarie per creare la camera posteriore che terrà il ganglio cerebrale. Versare Sylgard in entrambe le sezioni fino ad un'altezza di circa 3 mm al di sotto del livello superiore. La camera cerebrale dovrebbe essere leggermente inferiore alla piattaforma gangli buccale. Anche in questo caso, lasciare che il Sylgard set durante la notte.
6. Infine, versare la camera anteriore (cioè, la camera in cui la massa buccale sarà sospeso). Non sono necessarie le pareti. Versare all'altezza appropriata come specificato in Figura 1.
7. Il passo finale è quello di tagliare una tacca il collegamento della piattaforma buccale gangli e la camera cerebrale. La profondità della tacca deve essere uguale al livello della piattaforma gangli buccale. Una lama di bisturi può essere usato per tagliare la tacca. Figura 1 illustra il piatto completato.

3. Elettrodo Preparazione

1. Tirare e extracellularelectrodes da singolo a canna capillare di vetro con un Flaming-Brown micropipetta estrattore. Diametro interno degli elettrodi deve essere di circa 40 pm e le loro resistenze dovrebbe essere di circa 0,1 MW. Con il filamento FT345B nella estrattore, le nostre tipiche impostazioni del programma estrattore di calore sono 480, Pull 50, Vel 13, e ora 20, ma si noti che le impostazioni sarà diverso per i diversi filamenti. Questo programma crea gli elettrodi in una singola estrazione senza fuoco lucidatura stadio. Prima di iniziare un esperimento, recupero gli elettrodi extracellulari con Aplysia salina.
2. Creare elettrodi gancio per nervo e muscolo registrazione ² seguendo un protocollo analogo a quello descritto da Cullins Chiel e ^4, tranne che singoli elettrodi non devono essere avvolto intorno all'altro. I passi per la creazione di questi elettrodi seguire 3,3-3,13.
3. Tagliare un pezzo di smalto-rivestiti, 0,001 pollici di diametro del filo in acciaio inox per una lunghezza di circa 60 cm. Allegare una palla di plastilinaa ciascuna estremità del filo, tenere il filo in aria al suo punto medio, e girare le due palline di argilla intorno a vicenda per avvolgere i fili intorno all'altra (questo riduce transienti capacitivi).
4. Tenere le due estremità del filo insieme unendo le due palline di argilla in una palla, nastro e l'altra estremità del filo di sospendere il filo.
5. Rivestire l'intera lunghezza del filo di colla famiglia silicone mettendo un poco di colla sul pollice, toccando il pollice e l'indice insieme sul filo, e nel loro impiego in rete. Lasciate asciugare la colla durante la notte.
6. Dopo la colla asciuga, posizionare il filo su una superficie piana sotto un microscopio binoculare dissezione. Tagliare l'estremità del filo che era precedentemente mezzo, con conseguente due distinti fili intrecciati insieme. Questo è un elettrodo differenziale.
7. Utilizzare nastro per tenere una delle estremità del elettrodo in posizione. Utilizzando pinze per togliere la colla e smalto, preparare entrambi i fili ad una estremità ad avere circa 2 cm of senza cavi con circa 1 cm di cavo spelato di smalto. Saldare un connettore oro a ciascuno dei fili, e lab nastro posto attorno ai perni tenerli separati.
8. All'altra estremità dell'elettrodo, preparare i fili di avere circa 3 mm di filo libero. Rimuovere lo smalto dalle ultime circa 1 mm di un filo, e piegare il filo indietro e fuori del modo. Questo è il filo di riferimento. È fondamentale che i due fili non hanno filo nudo toccano.
9. Rimuovere lo smalto da altro filo fino alla colla di silicone. Torcere questo filo in un gancio e tagliarla ad una lunghezza di circa 1 mm. Questo gancio si allega al nervo o muscolo. Utilizzando un gancio corto fornisce maggiore stabilità quando il nervo è collegato all'elettrodo.
10. Utilizzare un multimetro per verificare che l'elettrodo sia ben costruito e intatto. Un connettore oro dovrebbe avere una lettura di resistenza di circa 200-500 ohm rispetto alla punta di un filo, e l'altro oro collegareo dovrebbe avere una lettura simile rispetto all'altro filo.
11. Se non c'è una connessione intatta su un cavo, può essere possibile ri-striscia la estremità del filo e di ri-saldare uno o entrambi i connettori oro per creare queste connessioni. Se entrambi i connettori oro hanno connessioni con entrambi i fili, l'elettrodo può avere due fili nudi fare contatto. Può essere possibile fissare l'altra estremità per eliminare questo problema, altrimenti, l'elettrodo deve essere scartato.
12. Ripetere questa procedura per come elettrodi quanti sono necessari per l'esperimento. Elettrodi gancio può essere riutilizzato da esperimento a esperimento tagliando la fine che attaccato al nervo e creare nuovi ganci, finché il filo diventa troppo breve dopo molti usi. Ogni volta che questo è fatto, utilizzare il multimetro per verificare che l'elettrodo sia intatto.
13. Per tenere traccia dei diversi elettrodi durante gli esperimenti, elettrodi etichette e relativi cavi. Utilizzando colori diversi di nastro di laboratorio è utile.

4. Dissezione degli animali e preparazione di massa buccale

1. Scegli un animale sano di circa 200-300 g di peso. Quando viene presentato con alghe, l'animale deve produrre morsi con protractions forti a intervalli regolari di 3-5 sec.
2. Posizionare l'animale in un vassoio dissezione e anestetizzare iniettando circa il 50% di soluzione isotonica di cloruro di magnesio peso corporeo. Effettuare la prima iniezione con la siringa a circa 15 a 30 gradi, vicino al centro e verso la coda dell'animale. Dopo l'iniezione, massaggiare delicatamente la superficie dell'animale per diffondere il cloruro di magnesio. Effettuare iniezioni addizionali come necessario con la siringa rivolta verso la testa dell'animale.
3. Dopo che l'animale non risponde a stimoli tattili dolci, pin l'animale sul lato vassoio, dorsale fino, con un pin in coda e un pin per ogni tentacolo anteriore.
4. Utilizzare pinze per stringere e sollevare la pelle dell'animale al centro della testa, dietro i rinofori. Make una incisione coronale attraverso la testa dell'animale, appena dietro il punto in corso. Poi fare un'incisione sagittale mediano andando avanti tra i rinofori verso la bocca, esponendo la massa buccale.
5. Usare pinze per tirare il lembo di pelle più vicino a te lontano dalla massa buccale, e tagliare i nervi e tessuto connettivo che si attaccano alla parete del corpo di separare completamente questo lembo di pelle dalla massa buccale. Fare attenzione a non tagliare i nervi o tessuto intrinseca alla massa buccale.
6. Usare pinze per afferrare e tenere l'esofago. Tagliare la parte posteriore esofago, fino al punto che si terrà. Sollevare l'esofago per sollevare la massa buccale come i tagli sono apportate le seguenti.
7. Dietro la massa buccale, il cerebrale, pleurico, e gangli forma pedale un anello, con il ganglio cerebrale collegato ai gangli vestibolare dai cerebrale-vestibolari connettivi (CBC). Lasciare questi gangli anello collegato alla massa buccale, e tagliare tutti i nervi sporgenti da questi gangli ad altre partiil corpo.
8. Tagliare il tessuto connettivo attorno alla massa buccale, continuando a sollevare la massa fino buccale quanto diventa meno collegato al corpo. Una volta che la massa buccale è solo attaccato alla bocca, l'esofago e la massa buccale dovrebbero tenersi verso l'alto.
9. Effettuare un taglio finale appena anteriormente alle ganasce per liberare la massa buccale dal corpo. Posizionare la massa buccale in una soluzione di 50% soluzione isotonica di cloruro di magnesio e 50% soluzione salina Aplysia per mantenere anesthetization parziale mentre elettrodi sono collegati.
10. Posizionare la massa buccale, con la soluzione, in una piastra di Petri con fondo Sylgard. Rimuovere i gangli pleurico e pedale, tagliando i loro collegamenti con il ganglio cerebrale. Lasciare il ganglio cerebrale collegato ai gangli vestibolare e la massa buccale tramite i cerebrale-vestibolari connettivi (CBC), tagliare gli altri collegamenti tra il ganglio cerebrale e massa buccale. Tagliare l'esofago e ghiandole salivari di piccoli tronchi in modo che non get in mezzo.

5. Hook elettrodo Allegato

1. Per la registrazione e la stimolazione, elettrodi gancio può essere attribuita ad una serie di diversi nervi e muscoli, come appropriato per l'esperimento (Figura 2).
2. Per caratterizzare schemi come dimostrato in vivo da Cullins Chiel e ^4, collegare elettrodi al nervo radular I2, il muscolo e nervi vestibolari 2 e 3. Insieme, queste registrazioni mostrano l'attività dei motoneuroni per i muscoli principali intrinseci alla massa buccale ^3,7,8, ea consentire l'identificazione della fase di protrazione dalla registrazione I2 ^3, la fase di retrazione dai nervi buccale 2 e 3 registrazioni ^{2 , 5,8,} e la tempistica di chiusura del grasper cibo dal ² radular registrazione del nervo. Collegare un elettrodo supplementare gancio al ramo una di 2 nervo vestibolare per la stimolazione pattern. Fissaggio di elettrodi segue una procedura analoga a quella dimoEd. by Cullins Chiel e ^4, ed è descritto nella seguente procedura.
3. Per ciascun allegato elettrodo, posizionare l'elettrodo su un manipolatore grossolana. Per il manipolatore, il nastro di un bastone di legno con un coccodrillo sulla sua estremità e utilizzare la clip per tenere l'estremità dell'elettrodo. La clip deve allegare alla siliconata sezione dell'elettrodo, circa 1 cm prima della fine del rivestimento siliconico. Utilizzare il manipolatore per posizionare l'elettrodo gancio vicino alla massa buccale.
4. Con la massa sul lato buccale e disposta contro il lato del piatto per la stabilità, iniziare con il nervo radular, che presenta l'attacco elettrodo più difficile. Ci sono due opzioni per l'accesso a questo nervo.
5. I progetti nervose radular da sotto il ganglio vestibolare e va sotto il muscolo I2 in due rami. In primo luogo, verificare se il nervo radular si può accedere senza tagliare il muscolo. Spingere delicatamente da parte la guaina bianca allegando i gangli vestibolare al muscolo I2; do non tagliare questa guaina. Se il nervo è accessibile, utilizzare pinze con la punta piegata in un gancio per sollevare un ramo del nervo.
6. Se il nervo radular non è accessibile in questo modo, una seconda opzione è quella di individuare il nervo sotto il muscolo sottile I2, e fare una piccola incisione I2 per esporre il nervo. Questa incisione dovrebbe passare attraverso due strati di muscoli. Utilizzare le pinze a gancio per tirare un ramo del nervo radular da sotto il muscolo.
7. Utilizzare il manipolatore per posizionare gancio dell'elettrodo accanto al nervo. Per posizionare il nervo nel gancio, è utile tenere il nervo nelle pinze uncinate mentre simultaneamente utilizzando un altro paio di pinze per creare una separazione tra le due metà del nervo in corso.
8. Dopo il nervo è saldamente il gancio, utilizzare il manipolatore per sollevare il nervo dalla massa buccale finché è tesa, ma non sforzatevi.
9. Prendete un Kimwipe e strettamente girare un angolo in modo da formare uno stoppino piccolo. Utilizzare questo stoppino per asciugare laestremità dell'elettrodo e la sezione del nervo che è agganciato.
10. Utilizzare un altro insieme di curve-punta pinza per applicare un poco di colla rapida Gel super per il nervo agganciato. Iniziare l'applicazione in corrispondenza del punto di contatto tra filo e del nervo. Assicurarsi che il gancio è completamente coperto con colla, e che la punta del filo di riferimento non è coperto con colla (Figura 3).
11. Utilizzare una siringa con un allegato tubo di polietilene ad applicare la soluzione dal piatto sulla colla, che indurrà la superficie della colla per impostare. Assicurarsi di bagnare completamente la colla con soluzione per garantire che la colla imposta correttamente.
12. Utilizzare il manipolatore per rilasciare la tensione sul nervo, e quindi rilasciare l'elettrodo dalla clip. Questo completa la procedura di collegamento di un elettrodo gancio.
13. La I2 elettrodo muscolo deve essere allegata prossimo. Abbiamo registrare l'attività EMG del muscolo I2, piuttosto che dalla sua attività ENG nervi innervano perché il nervo I2 è molto small e di difficile accesso in una massa intatta buccale. Vicino nervo vestibolare 2, utilizzare le pinze uncinate per sollevare una o due fasce del muscolo I2, e utilizzare un altro paio di pinze per separarli dal resto del muscolo. La porzione di I2 separato dovrebbe essere simile in spessore per nervo vestibolare 2 o 3. Fare attenzione a non più di gestione separata (che può denervate il muscolo). Applicare elettrodo gancio con la stessa procedura utilizzata per il nervo radular.
14. L'elettrodo accanto a fissare è che per un ramo del nervo vestibolare 2. Questo ramo può essere stimolati elettricamente per indurre programmi motori ^9. Prima del nervo vestibolare 2 va sotto il muscolo I1 alla scanalatura laterale, il nervo trifurcates, un ramo è il primo ramo di scindere. I rami sono abbastanza piccole, in modo che il fissaggio dell'elettrodo deve essere fatto con cura. Seguire la stessa procedura per collegare l'elettrodo.
15. Nervi vestibolari 2 e 3 sono facilmente accessibili. Seguire la stessa procedura, allegando gli elettrodielettrodi o meno a metà strada tra il ganglio vestibolare e la scanalatura laterale.
16. Per distinguere neuroni con proiezioni unilaterali vs bilaterale, è anche utile per collegare gli elettrodi ai nervi vestibolari 2 e 3 sul lato della massa buccale, nonché nervo vestibolare 2 un ramo, perché alcuni neuroni rispondono differentemente alle vs ipsilaterale . controlaterale BN2-una stimolazione.

6. Posizionamento del Ganglion e assottigliamento della guaina

1. La massa buccale verrà spostato alla fase 100 x 50 millimetri piatto Pyrex descritto nella sezione 2. Vedere la Figura 1.
2. Applicare uno strato sottile di grasso per vuoto alla tacca tra le camere cerebrali e vestibolare, con una punta di pipetta per raccogliere un poco di grasso per vuoto e stenderlo sopra la tacca. Abbiamo trovato che il grasso per vuoto riduce perdite meglio di vaselina. Riempire la camera anteriore con soluzione salina Aplysia. Spostare con attenzione la massa buccale dalla capsula di Petri alla chamb anterioreer di questo piatto più grande, facendo in modo che nessuno degli elettrodi sono tirata, che potrebbe rompere i nervi.
3. Se il piatto deve essere trasferito in un altro microscopio binoculare da dissezione per diluire la guaina, essere molto attenti con gli elettrodi gancio. Gruppo elettrodi su un lato della massa buccale insieme, e anche del gruppo di elettrodi sul lato della massa buccale insieme. Afferrare con attenzione gli elettrodi afferrando il nastro laboratorio che copre i pin del connettore, ancora una volta facendo in modo che nessuno degli elettrodi sono tirata.
4. Quando il piatto è posizionato sotto il microscopio, gli elettrodi devono essere drappeggiato delicatamente sopra i lati del piatto e di riposo sulla piattaforma accanto al piatto.
5. Durante le pause e tra le fasi dell'esperimento, aerare la soluzione salina nella camera di massa buccale con una pietra porosa acquario.
6. Pin il ganglio cerebrale nella parte posteriore con le cerebro-vestibolari connettivi (CBC) che attraversano la tacca. Applicare il vuoto più grease sulle CBC, quindi aggiungere salina Aplysia più per entrambe le parti del piatto, in modo gangli sono completamente sommerse. Assicurare che la quantità di grasso per vuoto aggiunto è superiore al livello di soluzione salina in né delle camere cerebrali o buccale quindi non si verificano perdite tra le camere. In questa fase, la massa buccale deve poggiare sul fondo della camera anteriore per non tirare con troppa forza sui nervi e gangli.
7. Pin i gangli vestibolare sulla piattaforma centrale. Per evitare di danneggiare i nervi che sono ancora attaccati alla massa buccale, solo posizionare i perni sulla guaina tra due nervi. Aggiungere due perni più sul lato delle CBC per allungare e ancorarle.
8. Tenere il piatto buccale gangli o ruotato in base alla posizione dei neuroni di interesse. Per ruotare il ganglio vestibolare, utilizzare una pinza sottile da acchiappare guaina superiore al CBC e il pin verso il basso tra i nervi vestibolari 2 e 3. Poi la maggior parte dei corpi cellulari che sono in prossimità della camera posteriore e non può essere facilly accessibile dalla parte superiore del ganglio vestibolare può essere visto. Infine, aggiungere due perni sulla guaina del ganglio vestibolare prossimità del lato buccale massa per minimizzare il movimento del ganglio vestibolare. Vedere la Figura 4.
9. Utilizzare una pinza sottile per afferrare la guaina del ganglio vestibolare in prossimità della camera posteriore, e poi tagliare la guaina in eccesso con le forbici sottili senza esporre i corpi cellulari. Al fine di minimizzare i danni, rimuovere solo la quantità di guaina necessario vedere i corpi cellulari.

7. Stimolazione e registrazione

1. Dopo aver sfoltito della guaina è stata completata, allegare tutti gli elettrodi alle loro prese sui cavi che collegano agli amplificatori. Anche in questo caso, assicurarsi che gli elettrodi non sono tirata mentre si fa questo. Assicurarsi che gli elettrodi siano correttamente attaccati ai loro cavi appropriati e che le polarità siano corrette.
2. Per lavare ogni residuo di cloruro di magnesio, sostituire il Aplysiuna soluzione salina nella camera massa buccale con soluzione salina Aplysia fresca.
3. Infilare una sutura di seta attraverso il tessuto molle nella parte anteriore della massa buccale, anterodorsal alla cartilagine mandibola, e utilizzare due pezzi di plastilina per fissare la sutura al bordo del piatto, così sospendendo la massa buccale dalla sua estremità anteriore. Si noti che l'estremità posteriore è sospesa dai nervi vestibolari collegati ai gangli buccale.
4. Posizionare un manipolatore in possesso di un elettrodo extracellulare di vetro in modo che la punta dell'elettrodo è vicino al ganglio vestibolare.
5. Per individuare e identificare un neurone, utilizzare il manipolatore per premere delicatamente la punta dell'elettrodo extracellulare giù sulla guaina sul soma neurone (Figura 5). Applicare una corrente stimolante, e quindi passare il canale che viene utilizzato per eccitare la soma di modalità di registrazione per registrare l'attività sull'elettrodo extracellulare e corrispondente attività sui nervi (Figura 6). Fare riferimentoalle mappe e le descrizioni pubblicate gangliari neuroni, comprese le proiezioni nervose e muscolari, innervazioni (ad esempio ^7,8) per l'aiuto nella identificazione dei neuroni.
6. Per la registrazione video dei programmi di alimentazione, posizione specchio al lato del piatto in modo che le viste frontale e laterale della massa buccale può essere vista contemporaneamente (posizione dello specchio è illustrato schematicamente in figura 1). Posizionare una videocamera con entrambe le viste frontale e laterale nel suo campo visivo.
7. Le registrazioni video ed elettrofisiologiche possono essere sincronizzati con l'invio di un impulso TTL sia ad un timer elettronico in vista della fotocamera e di un canale in AxoGraph, il programma informatico utilizzato per registrare e analizzare i dati elettrofisiologici. Questo impulsi fornisce un punto di tempo che è esattamente la stessa nelle registrazioni AxoGraph e video, in base al quale i file possono essere sincronizzati.
8. Dopo un neurone si trova, la sua attività può essere registrato in diversi alimenti come i comportamenti, che can essere provocato come descritto di seguito.
9. Per indurre il rigetto-come programmi motori, stimolare BN2-a con un lungo strascico di 2 Hz, 1 msec impulsi ⁹ (la nostra esperienza è che questa stimolazione genera affidabile modelli egestive in questo contesto). Patterns continua per tutta la durata della stimolazione e può continuare fino a poco dopo la stimolazione è finita.
10. Per indurre mordere-come programmi motori ^12, posizionare alcuni cristalli di carbacolo solido direttamente sul ganglio cerebrale. Alternativamente, se un livello controllato di esposizione carbacolo è necessario utilizzare una soluzione di tra 1 e 10 mM carbacolo in Aplysia salina. Concentrazioni maggiori hanno maggiori probabilità di produrre risposte. Motivi ripetitivi inizia in genere entro 5 minuti, e durano circa 10 a 15 minuti prima di iniziare a correre giù.
11. Per ingerire nulla simile a programmi motori ^13, si applicano carbacolo, e attendere fino a quando la massa buccale genera morsi forti. Poi, durante un morso, mettere una strisciadi alghe (laver essiccato) in bocca dell'animale in modo che la radula afferra l'alga (Figura 7). Strisce sono di solito 0,5 centimetri di larghezza e di lunghezza di 5 cm.
12. Dopo la prima serie di carbacolo indotte modelli, è spesso possibile ottenere ulteriori risposte carbacolo. Lavare accuratamente la salina Aplysia nella camera ganglio cerebrale, rimozione e sostituzione della soluzione salina almeno tre volte. Attendere almeno 20 minuti prima di applicare carbacolo nuovo. In attesa fino a 40 minuti possono dare risultati più affidabili.

In questo momento negli Stati Uniti, animali invertebrati non richiedono l'approvazione formale da parte di un uso animale istituzionale e commissione cura. Tuttavia, ci siamo assicurati che tutti i trattamenti di Aplysia minimizzare i danni e sofferenze agli animali, e che tutte le dissezioni sono fatto mentre l'animale è completamente anestetizzato.

Risultati

Quando un elettrodo extracellulare viene posizionato sopra il soma di un neurone e utilizzato per stimolarlo, può essere osservata una corrispondenza uno-a-uno tra gli impulsi registrati sul canale del soma e quelli sui nervi a cui il neurone proietta (Figura 6, pannello sinistro, stimolazione del neurone identificato B9). Il canale del soma (canale superiore) viene impostato in modalità stimolazione quando viene applicata la corrente (tempo 1 nella figura), quindi viene rapidamente commutato in modalità...

Discussione

Il lavoro precedente ha caratterizzato Aplysia programmi motori in intatta di un animale e nelle preparazioni ridotto come gangli isolato. Nell'animale intatto, anche se le registrazioni di singoli neuroni sono stati ottenuti ^5, tali esperimenti sono molto difficili, e gli elettrodi non può essere spostato da neurone a neurone durante l'alimentazione. In gangli isolato, i movimenti alimentazione indotte da attività neurale non può essere osservato. La preparazione massa sospesa buccale colma ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	S671	Biologico, Certificato
Cloruro di potassio	Fisher Scientific	P217	Certificato ACS
Cloruro di magnesio esaidrato	Acros Organics	19753	99%
Solfato di magnesio eptaidrato	Fisher Scientific	M63	Certificato ACS
Cloruro di calcio diidrato	Fisher Scientifc	C79	Certificato ACS
Glucosio (destrosio)	Sigma-Aldrich	G7528	BioXtra
Tampone MOPS	Acros Organics	17263	99%
Carbacholo	Acros Organics	10824	99%
Idrrossido di sodio	Fisher Scientific	SS255	Certificato
Acido cloridrico	Fisher Scientific	SA49	Certificato
Vetro capillare monobuco	A-M Systems	6150
Microelettrodo puller modello Flaming-Brown P-80/PC	Sutter Instruments		Filamento utilizzato: FT345B
Filo di acciaio inossidabile smaltato	California Fine Wire		0,001D, rivestimento h
Colla in silicone Household Silicone II	GE
Supercolla Duro Quick-Gel	Henkel corp.
Amplificatore A-M Systems modello 1700	A-M Systems		Impostazioni del filtro: 300-500 Hz nervi, 10-500 Hz muscolo I2
Stimolatore multicanale Pulsemaster	World Precision Instruments	A300
Isolatore di stimolo	World Precision Instruments	A360
AxoGraph X	AxoGraph Scientific
Contatore totale Veeder-Root	Danaher	C342-0562
Pins Connettori Dorati	Bulgin	SA3148/1
Prese Connettori Dorate	Bulgin	SA3149/1
Elastomero in silicone Sylgard 184	Dow Corning
Piatto cristallizzatore 100 x 50 mm	Pyrex
Grasso per vuoto alto	Dow Corning
Punte per pipetta	Fisher Scientific	21-375D
Puntine Minutien	Fine Science Tools	26002-10
Plastilina	Sargent Art	22-4400
Pinze chirurgiche in seta	Ethicon	K89OH
Pompa d'aria Whisper	Tetra	77849
Tubo per acquario	Eheim	7783	12/16 mm
Pietra aerante Elite	Hagen	A962
Forbici a molla Vannas	Fine Science Tools	15000-08
Pinze fini Dumont n. 5	Fine Science Tools	11254-20
Alga nori per sushi Yaki	Rhee Bros
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155