La logica, passaggi sperimentali, e le potenzialità di eterologa Biosintesi prodotto naturale Con l&#39;antibiotico Eritromicina Complesso A prodotti attraverso<em&gt; E. coli</em

Sommario

La biosintesi eterologa di eritromicina A attraverso E. coli Comprende le seguenti fasi sperimentali: 1) trasferimento genetico, 2) ricostituzione eterologa, e 3) l'analisi del prodotto. Ogni passo verrà spiegato nel contesto della motivazione, potenziale, e sfide nella produzione di prodotti terapeutici naturali usando E. coli Come host surrogato.

Abstract

La produzione eterologa di complessi prodotti naturali è un approccio progettato per affrontare le attuali limitazioni e le possibilità future. È particolarmente utile per quei composti che possiedono un valore terapeutico ma non può essere sufficientemente prodotto o trarrebbero beneficio da una nuova forma di produzione. Le procedure sperimentali oggetto può essere suddiviso in tre componenti: 1) trasferimento genetico; 2) ricostituzione eterologa e 3) l'analisi del prodotto. Ogni componente sperimentale è in fase di continua ottimizzazione per affrontare le sfide e anticipare le opportunità associati a questo approccio emergente.

Biosintesi eterologa inizia con l'identificazione di una sequenza genetica responsabile di un prodotto naturale. Trasferire questa sequenza in un ospite eterologo è complicata dalla complessità via biosintetica responsabile della formazione del prodotto. L'antibiotico eritromicina A è un buon esempio. Venti geni (pari a> 50 kb) sono necessari per la biosintesi eventuale. Inoltre, tre di questi geni codificano megasynthases, multi-dominio enzimi ciascuna ~ 300 kDa nella dimensione. Questo materiale genetico devono essere progettati e trasferiti E. coli per la biosintesi ricostituito. L'uso di isolamento PCR, costruzione operone, multi-cystronic plasmidi, ed elettro-trasformazione sarà descritto nel trasferire l'eritromicina Un cluster genetico E. coli.

Una volta trasferita, la E. coli cella deve supportare biosintesi finale. Questo processo è anche impegnativo viste le differenze sostanziali tra E. coli e la maggior parte dei padroni di casa originali responsabili della complessa formazione del prodotto naturale. La cella deve fornire substrati necessari a sostenere la biosintesi e coordinately esprimere il cluster trasferito genetica di produrre enzimi attivi. Nel caso di eritromicina A, la E. coli cella doveva essere progettato per fornire i due precursori (propionyl-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA) necessari per la biosintesi. Inoltre, le modifiche di sequenze genetiche, il numero di copie del plasmide, chaperonin co-espressione, post-traslazionale modifica enzimatica, e la temperatura di processo sono stati anche tenuti a consentire eritromicina finale Una formazione.

Infine, la produzione di successo deve essere valutata. Per l'eritromicina Un caso, presenteremo due metodi. La prima è la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) per confermare e quantificare la produzione. La bioattività di eritromicina A sarà inoltre confermata mediante uso di un saggio biologico in cui viene testata l'attività antibiotica contro il Bacillus subtilis. I saggi di valutazione stabiliscono eritromicina A biosintesi da E. coli e posto le basi per i futuri sforzi di progettazione per migliorare o diversificare la produzione e per la produzione di nuovi composti naturali complessi che utilizzano questo approccio.

Introduzione

Eritromicina A è un antibiotico polichetide prodotto dal Gram-positivi suolo batterio Saccharopolyspora erythraea, e la produzione di corrente è stato poco incrementato a ~ 10 g / L in decenni di mutagenesi tradizionale e protocolli di screening e più recentemente attraverso schemi di ottimizzazione di processo ^1-6. Strategie di mutagenesi e screening sono comuni in antibiotico sviluppo prodotto naturale a causa di difficoltà di coltura e / o manipolare geneticamente host di produzione nativi e causa dell'attività prontamente disponibili antibiotico o fenotipi crescita migliori per facilitare la selezione. Nel caso di eritromicina A, S. erythraea è limitata da un profilo di crescita lenta e la mancanza di tecniche di manipolazione genetica diretta (relativa organismi come E. coli), quindi, ostacolando rapidi miglioramenti nella produzione e biosintesi di nuovi derivati. Dopo aver riconosciuto i problemi di produzione e sbloccato diversificatisulla possibilità con composti come eritromicina A, la comunità di ricerca ha iniziato a perseguire l'idea della biosintesi eterologa (Figura 1) ^7. Questi sforzi hanno coinciso con informazioni di sequenza disponibili per l'eritromicina Un gene del cluster ^8-11. Va sottolineato che il numero di sequenza cluster prodotto naturale complesso gene ha notevolmente ampliato ^12-16, fornendo lo stimolo a proseguire gli sforzi biosintesi eterologa di accesso codificato potenziale medicinale. Per fare ciò, la ricostituzione eterologo richiede che il nuovo host soddisfare le esigenze della via di biosintesi specifico. E. coli fornisce la convenienza tecnico, una vasta gamma-spanning di tecniche di biologia molecolare, e le strategie di ingegneria metabolica e di processo per lo sviluppo del prodotto. Tuttavia, rispetto ai padroni di casa di produzione nativi, E. coli non presenta lo stesso livello di produzione complesso prodotto naturale. Era quindi noto se E. coli potrebbe servire come una valida opzione per il complesso eterologa biosintesi prodotto naturale. Tuttavia, si è ipotizzato che E. coli sarebbe un organismo ospite ideale se biosintesi eterologa potrebbe essere realizzato.

Con questo obiettivo in mente, gli sforzi iniziali ha cominciato a produrre l'aglicone polichetide 6 desossieritronolide B (6dEB) attraverso E. coli. Tuttavia, nativo E. metabolismo coli non potrebbe fornire livelli apprezzabili della propionil-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA precursori necessari per supportare biosintesi 6dEB né poteva il nuovo host post-traduzionale modificare il desossieritronolide B sintasi (DEBS) enzimi. Per porre rimedio a questi problemi, una via metabolica composto da enzimi nativi ed eterologhi è stato costruito in E. coli tali che esogenamente propionato è stato alimentato convertiti intracellularmente a propionil-CoA e quindi (2S)-metilmalonil-CoA, durante la progettazione di completare questo percorso, un gene sfp è stato posto in thcromosoma e di E. coli BL21 (DE3) per produrre un nuovo ceppo chiamato BAP1. L'enzima SFP è in grado phosphopantetheinyl transferasi di attaccare il 4'-phosphopantetheine cofattore per gli enzimi DEBS ^17,18. I tre geni DEBS (ogni ~ 10 kb) sono state poi poste su due vettori di espressione inducibili separatamente selezionabili contenenti promotori T7. Dopo una chiave di regolazione post-induzione temperatura (a 22 ° C), i geni sono stati DEBS coordinately espressa all'interno BAP1 in uno stato attivo in grado di generare 6dEB ^19.

Il perseguimento di eritromicina A pieno biosintesi poi ha iniziato ad usare un cluster analogo gene da Micromonospora megalomicea o un percorso ibrido composto da geni di S. erythraea, S. fradiae, e S. venezuelae che ha prodotto l'intermedi eritromicina C e 6-deoxyerythromycin D, rispettivamente ^20-22. Recentemente, il nostro gruppo ha esteso questi sforzi con la produzione di erythromycin A (la forma più clinicamente rilevante di eritromicina) attraverso E. coli. In contrasto con il lavoro precedente, la nostra strategia coordinately espresso il 20 originario di S. erythraea geni necessari per la biosintesi polichetide, biosintesi deoxysugar e l'attaccamento, sartoria supplementare, e di auto-resistenza (Figura 2). In totale, 26 (nativo e eterologa) geni sono stati progettati per consentire E. coli per produrre eritromicina A a 4 mg / L ^23,24. Questo risultato stabilito produzione completa di un complesso prodotto polichetide naturale con E. coli e serve come base per sfruttare questa nuova opzione di produzione o l'esercizio di nuove.

Protocollo

Il seguente testo è specifico per l'antibiotico eritromicina A, ma i passaggi sono progettati per essere generalmente applicabile ad altri prodotti naturali come candidati per la biosintesi eterologa.

1. Eritromicina Un cluster di trasferimento genetico

1. Progettazione primer PCR per amplificare tutti i geni associati alla eritromicina A cluster all'interno S. erythraea cromosoma. Questo passo è specifico per i candidati di prodotti naturali le cui sequenze genetiche sono state determinate. In alternativa, i geni richiesti possono essere sintetizzati (attraverso diverse opzioni di fornitore commerciale) con il vantaggio che i geni di nuova sintesi sarà progettata per essere codon usage ottimale all'interno della nuova E. coli host. Se la sintesi del DNA è perseguito, una sfida attuale sta generando megasynthase geni che possono superare i 10 kb di lunghezza. Tecnicamente, la sintesi può essere realizzato, ma è difficile e costosa. Si prevede che improvem continuagenitori nella tecnologia genetica sintesi affronterà inconvenienti attuali e convalidare ulteriormente questo approccio per la fornitura di materiale genetico eterologo.
2. Effettuare PCR utilizzando preparata S. erythraea DNA genomico come stampo. Il DNA cromosomico può essere preparato da colture di S. erythraea o da scorte congelate del batterio (Figura 3) ^25. Le reazioni di PCR può beneficiare l'aggiunta di DMSO (4 microlitri 50 reazioni pl) per tenere conto elevato contenuto G+ C nel bersaglio S. erythraea geni. Ogni gene amplificato dovrebbero essere sequenziati per confermare che il gene completo è stato ritirato e che non mutazioni sono state introdotte durante il processo PCR.
3. Attraverso digest restrizione e ligazione, inserire ciascuno dei geni isolati in vettori di espressione progettati per E. coli (Figura 3). Viene avviato la progettazione di siti di restrizione all'interno dei primer PCR per consentire la digestione e ligazione in ex adattovettori pression (un esempio è stato incluso in Figura 3). Abbiamo usato sia pET21 e pET28 vettori. Il vettore pET28 consente l'inserimento di una sequenza leader 5 'che aiutato espressione genica nel eritromicina A caso. Confermare espressione individuale genica mediante RT-PCR, analisi SDS-PAGE (usando le frazioni proteiche solubili), o convenienti test fenotipici (Figura 4).
4. Costruire operoni basate su geni espressi con successo da plasmidi di espressione individuali (Figura 3). Abbiamo usato tradizionalmente combinazioni compatibili coesivi enzimi di restrizione (come Xba I e Spe I) ²⁴ per convertire sequenzialmente geni di operoni, tuttavia, i siti di restrizione scelti per la costruzione operone non devono risiedere all'interno (o deve essere rimosso dal) isolato sequenze di geni (un problema che può essere evitato se la sintesi gene è utilizzato). Questo passaggio consolida il 20 eritromicina A geni prima E. coli trasfrmazioni. Attualmente, abbiamo usato questo metodo per includere fino a 20 kb di DNA estraneo in un vettore pET standard (due geni di circa 10 kb ciascuno). Inoltre, abbiamo usato questo metodo per generare operoni contengono nove geni. Non è noto esattamente quanto DNA o quanti geni possono essere integrati in pET-tipo plasmidi, tuttavia, le metriche citate fornire un riferimento per sistemi complessi come la via biosintetica eritromicina. Infine, standard nelle fasi legatura in vitro e successive fasi di trasformazione di successo diventerà sempre più difficile, come operone e crescere della dimensione plasmide. Temperatura di legatura (12-22 ° C) e il tempo (3-24 ore) sono varie e elettro-trasformazione è utilizzato per aiutare il processo di produzione finali costrutti plasmidici.
5. Trasformare i plasmidi biosintetici di nuova concezione in E. coli ceppo BAP1 con elettro-trasformazione (Figura 5). La procedura può essere tentata con plasmidi introdotti sia in sequenza o in combination. Quando trasformando size-grado o plasmidi numerosi, abbiamo utilizzato tradizionalmente elettro-trasformazione (al contrario di trasformazione chimica). Una volta trasformate, le cellule sulla piastra di terreno LB solido contenente tetraciclina (5 mg / l), carbenicillina (100 mg / l), kanamicina (50 mg / l), streptomicina (50 mg / l), e apramicina (50 mg / l ) per selezionare per manutenzione plasmide. E 'molto insolito di utilizzare sei diversi selezione antibiotici post-trasformazione di un E. coli cella, ma questo riflette semplicemente il numero totale di plasmidi necessari per consentire finale eritromicina A biosintesi. Se possibile, l'approccio limitare le capacità di produzione del composto una volta che la coltura è iniziato (vedi sotto).

2. E. coli Biosynthetic Ricostituzione

1. BAP1 Strain è stato progettato per fornire i supporti necessari per la biosintesi e per la modifica post-traduzionale del megasynthase desossieritronolide B. Geni individuali del Erythromycin Un percorso sono stati testati per l'espressione genica e consolidata a partire operoni in plasmidi di espressione. Questa sezione è dedicata alle condizioni di coltura per verificare l'attività concertata della eritromicina Un percorso completo.
2. Prendere 3 colonie separate del BAP1 appena trasformato e inoculare colture LB 1,5 ml contenenti antibiotici necessari selezione plasmidici (alle stesse concentrazioni sopra indicate per selezionare trasformanti su terreno solido), isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG; 100 pM ) e arabinosio (2 mg / ml) per indurre l'espressione genica, e 20 mM di sodio propionato di sostenere intracellulare formazione precursore biosintetico. Una volta che la produzione è stata confermata, grandi colture possono essere condotte in un tentativo di scalare e massimizzare titoli prodotti.
3. Cultura le cellule a 22 ° C e 250 rpm per 24-48 ore. In questo caso, la selezione antibiotica assicura che i plasmidi richiesti sono mantenuti nelle prime fasi della coltura cellulare. Tuttavia, plasmides può essere facilmente perso come livelli di selezione antibiotica cambiare nel corso del periodo di coltura. Questo può portare a instabilità plasmide (cioè, la perdita di una o più plasmidi durante cultura), che sarebbe quindi limitare la capacità di produzione. Il problema si aggrava quando plasmidi compatibili vengono utilizzati per introdurre un cluster completa gene eterologo. Tale è il caso per l'eritromicina A composto (Figura 5) e dovrebbe essere posto rimedio alla sovrapproduzione veramente il composto da E. coli. Tuttavia, al fine di dimostrare produzione iniziale, tali difetti di progettazione sono tollerati per motivi di rapidità stabilire la fattibilità dell'approccio eterologo.
4. Chiarire le culture mediante centrifugazione a 10.000 rpm in una microcentrifuga Eppendorf. Rimuovere il surnatante e conservare a 4 ° C per l'analisi.
5. Nel caso di eritromicina A, mancanza di produzione composto è stato affrontato con l'inclusione del GroES / EL chaperonin (utilizzando pGro7specificamente per affrontare la mancanza di attività degli enzimi post-espressione) e l'inserimento di copie del gene (per quei geni sospettate di debole espressione / attività). Strategie simili possono essere necessari con altre iniziative di prodotti naturali di produzione eterologa.

3. Analisi dei prodotti

1. Per confermare e quantificare eritromicina A formazione, iniettare il supernatante di coltura su un sistema LC-MS (Figura 6). Eritromicina A disponibile in commercio è stata utilizzata per confermare la produzione e come standard durante quantificazione. Per i casi che non standard disponibili in commercio, LC-MS analisi richiederebbe ulteriore caratterizzazione chimica mediante NMR e spettrometria di massa ad alta risoluzione.
2. Confronta produzione tra i 3 colonie / culture dalla trasformazione BAP1. Scegli il massimo produttore e preparare uno stock di glicerolo dalla sorgente colonia. Questa fase può essere eseguita in parallelo con le culture di produzione dei Protocollo2 utilizzando una piccola porzione delle culture per preparare scorte glicerolo. Conservare lo stock di glicerolo in un congelatore a -80 ° C.
3. Utilizzando la conferma, più elevato capitale cellula produttrice, iniziare una cultura di produzione separata ed estrarre il surnatante finale con volume 2x acetato di etile. Usare un sistema di aspirazione evaporativo per asciugare l'estratto e risospendere in 100 microlitri metanolo. Trasferire l'estratto in un disco filtro sterile (diametro ~ 1/4 pollici) e permettono il disco ad asciugare. Separatamente, cultura B. subtillis in liquido LB durante la notte. Aggiungere 20 ml di B. subtilis cultura a 20 ml di agar LB liquido a 45 ° C. Piatto l'agar e lasciare solidificare. Posizionare il filtro a disco sulla piastra e incubare a 37 ° C (Figura 7). In alternativa, l'estratto può essere aggiunto a colture liquide all'interno di una piastra a 96 pozzetti per quantificare l'attività utilizzando un lettore di piastre (Figura 7).

Risultati

Il risultato desiderato di questo approccio è la produzione di un prodotto completamente naturale bioattivo dalla E. coli eterologhi host. Questo è meglio rappresentato dalle LC-MS risultati utilizzati per confermare e quantificare produzione (Figura 6) e il biotest antibatterico utilizzato per confermare l'attività finale (Figura 7). Nello schema generale della biosintesi eterologa, questo risultato definisce il successo. Una volta realizzato, gli sforzi di ricerca per poi...

Discussione

Fasi critiche biosintesi eterologa si riscontrano a ciascuno dei tre punti procedurali nel processo: 1) trasferimento genetico; 2) ricostituzione biosintetica e 3) l'analisi del prodotto. Un problema in qualsiasi fase farà deragliare l'obiettivo finale di creare biosintesi eterologa. Forse l'aspetto più impegnativo del processo è stabilire biosintesi ricostituita, dal momento che questo è assolutamente necessaria per consentire l'analisi di successo. Tuttavia, la ricostituzione dipende un'attenta pro...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
PCR macchina	Eppendorf	Mastercycler personale
Dimetilsolfossido (DMSO)	Pescatore	BP231
Elettroporatore	BioRad	Micropulser
IPTG	Pescatore	BP1620
Propionato di sodio	Sigma	P1880
L-arabinosio	Sigma	A3256
Refrigerato Shaker	Thermo Scientific	MaxQ 4000
Microcentrifugare	Eppendorf	Centrifugare 5415D
pGro7	Takara	Chaperone Set Plasmid (3340)
pET21, pET28, PCDF-Duet-1	EMD Chemicals	69742-3, 69864, 71340
LC-MS	Applied Biosystems	3200 Q-Trap
Acetato di etile	Sigma	270989
Metanolo	Sigma	322415
Vuoto centrifuga	Eppendorf	Concentrator 5301
Evaporatore rotante	Buchi	R-200