La biosintesi eterologa di eritromicina A attraverso E. coli Comprende le seguenti fasi sperimentali: 1) trasferimento genetico, 2) ricostituzione eterologa, e 3) l'analisi del prodotto. Ogni passo verrà spiegato nel contesto della motivazione, potenziale, e sfide nella produzione di prodotti terapeutici naturali usando E. coli Come host surrogato.
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Articolo metodologico
La logica, passaggi sperimentali, e le potenzialità di eterologa Biosintesi prodotto naturale Con l'antibiotico Eritromicina Complesso A prodotti attraverso
In questo articolo
Sommario
Abstract
La produzione eterologa di complessi prodotti naturali è un approccio progettato per affrontare le attuali limitazioni e le possibilità future. È particolarmente utile per quei composti che possiedono un valore terapeutico ma non può essere sufficientemente prodotto o trarrebbero beneficio da una nuova forma di produzione. Le procedure sperimentali oggetto può essere suddiviso in tre componenti: 1) trasferimento genetico; 2) ricostituzione eterologa e 3) l'analisi del prodotto. Ogni componente sperimentale è in fase di continua ottimizzazione per affrontare le sfide e anticipare le opportunità associati a questo approccio emergente.
Biosintesi eterologa inizia con l'identificazione di una sequenza genetica responsabile di un prodotto naturale. Trasferire questa sequenza in un ospite eterologo è complicata dalla complessità via biosintetica responsabile della formazione del prodotto. L'antibiotico eritromicina A è un buon esempio. Venti geni (pari a> 50 kb) sono necessari per la biosintesi eventuale. Inoltre, tre di questi geni codificano megasynthases, multi-dominio enzimi ciascuna ~ 300 kDa nella dimensione. Questo materiale genetico devono essere progettati e trasferiti E. coli per la biosintesi ricostituito. L'uso di isolamento PCR, costruzione operone, multi-cystronic plasmidi, ed elettro-trasformazione sarà descritto nel trasferire l'eritromicina Un cluster genetico E. coli.
Una volta trasferita, la E. coli cella deve supportare biosintesi finale. Questo processo è anche impegnativo viste le differenze sostanziali tra E. coli e la maggior parte dei padroni di casa originali responsabili della complessa formazione del prodotto naturale. La cella deve fornire substrati necessari a sostenere la biosintesi e coordinately esprimere il cluster trasferito genetica di produrre enzimi attivi. Nel caso di eritromicina A, la E. coli cella doveva essere progettato per fornire i due precursori (propionyl-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA) necessari per la biosintesi. Inoltre, le modifiche di sequenze genetiche, il numero di copie del plasmide, chaperonin co-espressione, post-traslazionale modifica enzimatica, e la temperatura di processo sono stati anche tenuti a consentire eritromicina finale Una formazione.
Infine, la produzione di successo deve essere valutata. Per l'eritromicina Un caso, presenteremo due metodi. La prima è la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) per confermare e quantificare la produzione. La bioattività di eritromicina A sarà inoltre confermata mediante uso di un saggio biologico in cui viene testata l'attività antibiotica contro il Bacillus subtilis. I saggi di valutazione stabiliscono eritromicina A biosintesi da E. coli e posto le basi per i futuri sforzi di progettazione per migliorare o diversificare la produzione e per la produzione di nuovi composti naturali complessi che utilizzano questo approccio.
Introduzione
Eritromicina A è un antibiotico polichetide prodotto dal Gram-positivi suolo batterio Saccharopolyspora erythraea, e la produzione di corrente è stato poco incrementato a ~ 10 g / L in decenni di mutagenesi tradizionale e protocolli di screening e più recentemente attraverso schemi di ottimizzazione di processo 1-6. Strategie di mutagenesi e screening sono comuni in antibiotico sviluppo prodotto naturale a causa di difficoltà di coltura e / o manipolare geneticamente host di produzione nativi e causa dell'attività prontamente disponibili antibiotico o fenotipi crescita migliori per facilitare la selezione. Nel caso di eritromicina A, S. er....
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Protocollo
Il seguente testo è specifico per l'antibiotico eritromicina A, ma i passaggi sono progettati per essere generalmente applicabile ad altri prodotti naturali come candidati per la biosintesi eterologa.
1. Eritromicina Un cluster di trasferimento genetico
- Progettazione primer PCR per amplificare tutti i geni associati alla eritromicina A cluster all'interno S. erythraea cromosoma. Questo passo è specifico per i candidati di prodotti naturali le cui sequenze genetiche sono state determinate. In alternativa, i geni richiesti possono essere sintetizzati (attraverso diverse opzioni di fornitore commerciale) con il va....
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Risultati
Il risultato desiderato di questo approccio è la produzione di un prodotto completamente naturale bioattivo dalla E. coli eterologhi host. Questo è meglio rappresentato dalle LC-MS risultati utilizzati per confermare e quantificare produzione (Figura 6) e il biotest antibatterico utilizzato per confermare l'attività finale (Figura 7). Nello schema generale della biosintesi eterologa, questo risultato definisce il successo. Una volta realizzato, gli sforzi di ricerca per poi.......
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Discussione
Fasi critiche biosintesi eterologa si riscontrano a ciascuno dei tre punti procedurali nel processo: 1) trasferimento genetico; 2) ricostituzione biosintetica e 3) l'analisi del prodotto. Un problema in qualsiasi fase farà deragliare l'obiettivo finale di creare biosintesi eterologa. Forse l'aspetto più impegnativo del processo è stabilire biosintesi ricostituita, dal momento che questo è assolutamente necessaria per consentire l'analisi di successo. Tuttavia, la ricostituzione dipende un'attenta pro.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il NIH (AI074224 e GM085323) e NSF (0.712.019 e 0.924.699) per il finanziamento a sostegno di progetti dedicati alla biosintesi eterologa.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| PCR macchina | Eppendorf | Mastercycler personale | |
| Dimetilsolfossido (DMSO) | Pescatore | BP231 | |
| Elettroporatore | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Pescatore | BP1620 | |
| Propionato di sodio | Sigma | P1880 | |
| L-arabinosio | Sigma | A3256 | |
| Refrigerato Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microcentrifugare | Eppendorf | Centrifugare 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Set Plasmid (3340) | |
| pET21, pET28, PCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Acetato di etile | Sigma | 270989 | |
| Metanolo | Sigma | 322415 | |
| Vuoto centrifuga | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Evaporatore rotante | Buchi | R-200 |
Riferimenti
- Adrio, J. L., Demain, A. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products. FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).
- Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Genetic engineering of ....
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Ristampe e permessi
