Articolo metodologico

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno Drosophila

DOI:

10.3791/4355

⸱

4 dicembre 2012

 ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Neurobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Per comprendere un collegamento tra la risposta immunitaria e il comportamento, si descrive un metodo per misurare il comportamento motorio in Drosophila Durante l'infezione batterica, nonché la capacità di mosche di montare una risposta immunitaria per la sopravvivenza di controllo, carica batterica, e in tempo reale delle attività di un regolatore chiave dell'immunità innata, NFκB.

Abstract

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Una complessa interazione tra la risposta immunitaria e comportamento host è stato descritto in una vasta gamma di specie. Sonno eccesso, in particolare, si verifica come risposta a infezione nei mammiferi e 1 è stata recentemente descritta in Drosophila melanogaster 2. E 'generalmente accettato che il sonno è vantaggioso per l'host durante un'infezione e che è importante per il mantenimento di un robusto sistema immunitario 3,4. Tuttavia, prove sperimentali che supporta questa ipotesi è limitata 4, e la funzione del sonno eccesso durante una risposta immunitaria è chiaro. Abbiamo usato un approccio multidisciplinare per affrontare questo problema complesso, e hanno condotto studi nel sistema semplice modello genetico, il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. Usiamo un test standard per misurare il comportamento locomotorio e dormire in mosche, e dimostrare come questo test viene utilizzato per misurare il comportamento di mosche infected con un ceppo di batteri patogeni. Questo saggio è utile anche per monitorare la durata della sopravvivenza in mosche singoli durante un'infezione. Ulteriori misure della funzione immunitaria includono la capacità di mosche per cancellare una infezione e l'attivazione di NFκB, un fattore di trascrizione chiave che è fondamentale per la risposta immunitaria innata in Drosophila. Sia esito di sopravvivenza e la clearance batterica durante l'infezione insieme sono indicatori di resistenza e tolleranza alle infezioni. Resistenza si riferisce alla capacità di mosche per cancellare un'infezione, mentre la tolleranza viene definita come la capacità di accoglienza per limitare i danni di un'infezione e quindi sopravvivere nonostante alti livelli di patogeni all'interno del sistema 5. Monitoraggio in tempo reale delle attività in corso di infezione NFκB permette di comprendere un meccanismo molecolare di sopravvivenza durante l'infezione. L'uso di Drosophila in questi saggi semplici facilita le analisi genetiche e molecolari di sonnoe la risposta immunitaria e come questi due sistemi complessi sono reciprocamente influenzati.

Protocollo

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Questo protocollo utilizza due configurazioni (Figura 1) per acquisire quattro letture differenti raccolti da mosche sottoposte ad una infezione batterica. Queste uscite sono 1) sonno / veglia comportamento, 2) esito di sopravvivenza; 3) carica batterica al volo e 4) misurazione in tempo reale di attività giornalista NFκB in vivo. In combinazione con gli strumenti genetici che sono disponibili in Drosophila, queste misurazioni forniscono informazioni meccanicistica sul legame molecolare tra la funzione immunitaria e comportamento.

1. Misurare l'attività locomotoria e del sonno in mosche

  1. La configurazione utilizzata per misurare l'attività locomotoria e dormire mosche, che include il sistema di attività di monitoraggio Drosophila (DAM2, Trikinetics), incubatori, camera oscura, e la preparazione degli animali da esperimento e tubi di attività, è stato descritto in precedenza 6. Lo stesso approccio è utilizzato qui, con qualche piccola modifica.
    1. L'illuminazione del incubatore è controllata dalla stessa incubatore. Pertanto, è importante sincronizzare l'impostazione del tempo tra computer e incubatori.
    2. Provette dell'attività sono pulite per il riutilizzo mediante ebollizione su piastra calda in acqua deionizzata. Una piccola quantità di detersivo viene aggiunto per primo l'ebollizione, i tubi sono ben sciacquati e bollito altre due volte. Se filato viene utilizzato per collegare il tubo, tubi all'attività usati (contenente cibo, cera, fly e filo) può essere pulito senza previa rimozione del filato.
  2. Prima di iniziare un esperimento, culture posto contenenti tardi pupa in scena mosche in incubatrici per tre o quattro giorni per adattarsi all'illuminazione sperimentale e altre condizioni ambientali. Luce: condizioni di oscurità o la costante sono stati comunemente usati per misurare il comportamento del sonno. In questo esempio, mosche sono acclimatati a luce costante per eliminare l'influenza dell'orologio circadiano sulla risposta immunitaria e comportamento 2,7,8. Come descritto in Figura 1A , di carico 1-4 mosche giorno di vita nell'attività Trikinetics DAM2 monitor come descritto 6 e record per un minimo di tre giorni prima l'infezione.

2. Infect mosche con un ceppo patogeno di batteri

  1. Il protocollo qui descritto è specifico per S. marcescens, che sono facili da coltivare e mantenere. Protocolli per la conservazione a lungo termine e condizioni di coltura per altre specie batteriche possono variare. S. marcescens sono memorizzati in 15-50% glicerolo a -80 ° C. Per preparare per conservazione a lungo termine, mescolare 2 volumi di coltura batterica durante la notte (OD 600 = 0.5 - 1.0) a 1 volume di autoclavato glicerolo al 50% in tubi microcentrifuga da 1,5 ml. Questo si tradurrà in una concentrazione finale di glicerolo 17%. Memorizzare provette a -80 ° C. Per preparare a breve termine in uso fonte di batteri, raschiare il brodo congelato con una sterile 200 microlitri puntale ed eseguire un tre vie striscia su una piastra di agar LB. Incubare la piastra durante la notte a 37 & dad esempio, C per ottenere colonie isolate. Conservare la piastra a 4 ° C.
    Un giorno prima che l'infezione in programma, scegliere una singola colonia dalla piastra di agar LB con una sterile 200 microlitri puntale e immergere la punta in una provetta contenente 5 ml di terreno LB. Crescere batteri durante la notte, o fino a 16 ore all'interno di un agitatore incubatore a 37 ° C e 250 rpm fino a raggiungere la fase di crescita esponenziale. Misurare la concentrazione con uno spettrofotometro a OD 600. La concentrazione in questa fase va da 0,5 a 1. Se la concentrazione è troppo elevata, eseguire sottocolture i batteri e crescere per altre diverse ore per ottenere una concentrazione ottimale. Eseguire la procedura nei pressi di una sorgente di fiamma. Alcuni ceppi batterici sono progettati per la resistenza antibiotica e vengono coltivate e selezionate per antibiotico appropriato aggiunto al mezzo. S. marcescens (ATCC # 8100) non sono resistenti agli antibiotici e quindi coltivate in mezzo sterile senza antibiotico. Per verificare tecnica sterile, fare un finto culri senza batteri come controllo.
    La soluzione di infettare mosche contiene batteri (diluito a OD 600 = 0.1) e coloranti alimentari 1% (blu brillante FCF) in PBS. Preparare una soluzione iniettabile di controllo aggiungendo quantità equivalente di terreno LB utilizzato in soluzione infezione e 1% colorante alimentare blu in PBS. Conservare le soluzioni su ghiaccio.
  2. Preparare gli aghi per l'iniezione di vetro le mosche. Tirare capillari di vetro (od = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) a una punta fine con un estrattore micropipetta (Narishige). Sotto un microscopio per dissezione, utilizzare una pinza sottile per rompere la punta dell'ago in modo che l'apertura è grande abbastanza da riempire con fluido iniezione aspirazione mediante una siringa, ma abbastanza piccolo per minimizzare i danni al volo durante il processo di iniezione. Dopo la rottura della punta, la grandezza della punta dovrebbe essere di circa 40-50 micron. L'ago di vetro è attaccato ad una siringa di plastica 3 cc con un pezzo di tubo. Il flusso del fluido di iniezione viene controllata manualmente applicando una pressione positiva o suzione con la siringa. Evitare di contaminare il tubo di gomma con iniezione di fluido, come l'apparato siringa viene utilizzata sia per infezione e iniezioni di controllo.
  3. Anestetizzare mosche mettendoli su un CO 2 pad. CO 2 viene fatto passare attraverso un contenitore sigillato di acqua per umidificare il pad e di ridurre l'elettricità statica, che può complicare la manipolazione di mosche sul pad. Iniettare mosche colpendo l'ago di vetro nella regione al di sopra della scutello del torace dorsale. Il passaggio del mezzo iniezione al volo viene verificata dal colorante alimentare - mosche diventano blu in quanto gli spread coloranti degli alimenti attraverso il sistema. La dose di batteri che ricevono mosche può essere quantificato come descritto nella sezione 3 di seguito. Alcuni disegni sperimentali includono un gruppo di controllo che riceve pregiudizio asettico, iniettando le mosche con coloranti PBS e cibo, ma senza batteri.

3. Determinare la carica batterica

Un approccio per evaluating la risposta immunitaria contro l'infezione batterica è determinare l'infezione batterica postale carico. D. melanogaster è un grande modello per determinare questo parametro, perché al volo tutto può essere omogeneizzato per stimare il numero totale di batteri all'interno di un individuo. La logica alla base di questo protocollo è che quando coltivate su un mezzo solido come brodo Luria (LB) agar in una piastra (piastra LB), un singolo batterio forma una colonia visibile distinguibile. Pertanto, omogeneizzando mosche infette in terreno LB liquido, generando diluizioni seriali del omogenato, e diffondere l'omogenato diluito su piastre LB, il numero di cellule batteriche infettare una mosca può essere determinato. Un gruppo di controllo di mosche iniettati con PBS e colorante alimentare ma senza batteri dovrebbero essere utilizzati per verificare che l'infezione non è stato contaminato con altre specie batteriche. Non ci dovrebbero essere colonie sulla piastra LB agar in questa condizione.

  1. Autoclavare tutti materiali che saranno utilizzati per questoprocedura prima di eseguire la fase effettiva omogeneizzazione. Questo comprende 200 puntali ul tagliati con le forbici, i media LB, e pestelli utilizzati per la omogeneizzazione. Preparare piatti versando autoclavato LB / agar in media 10 centimetri piatti Petri sterili almeno 1 giorno prima omogeneizzazione mosche.
  2. Anestetizzare e raccogliere le mosche in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare le provette su ghiaccio.
  3. Eseguire l'omogeneizzazione nei pressi di una fiamma per evitare la contaminazione. Una omogeneizzazione di controllo contenente le mosche senza infezione è consigliabile soprattutto quando si utilizza un ceppo batterico, come S. marcescens, che non sono resistenti agli antibiotici. Omogeneizzare un minimo di 2 gruppi di 10 mosche per ogni condizione sperimentale. Il numero di mosche utilizzati per omogenato è determinata dallo sperimentatore. Alcuni gruppi hanno utilizzato una mosca per omogeneizzato, che è utile per valutare la variazione della carica batterica tra le mosche singole 8, mentre altri ricercatori hanno utilizzato 3-10 mosche per omogenatodi confrontare tra genotipo o dalla condizione sperimentale 9-12.
    1. Aggiungere 400 microlitri LB medio a ciascuna provetta contenente mosche e omogeneizzare con un piccolo motore e pestello (Kontes).
    2. Utilizzando sterilizzati puntali tagliati, di serie diluire 1:10 omogeneizzato con l'aggiunta di 20 pl omogeneizzato LB / media batterica a 1,5 microprovetta microlitri contenente 180 microlitri media LB. Consigli per il taglio pipette prevenendo l'ostruzione da detriti volanti e assicura che un volume adeguato in fase di trasferimento.
    3. Fattore di diluizione viene determinato empiricamente e dipende dal genotipo della mosca, il ceppo batterico utilizzato, e condizione sperimentale. Per il tipo selvatico vola infettati con S. marcescens, utilizzare diluizioni di 1:10 2 o 1:10 3 per le mosche omogeneizzati immediatamente dopo l'infezione, e le diluizioni di 1:10 4 o 1:10 5 per mosche omogeneizzato 24 ore dopo l'infezione.
    4. Aggiungere 100 microlitri LB / media batterica dal microfonotubi rocentrifuge contenenti la diluizione finale e la diffusione del mezzo su una piastra di LB con sfere di vetro (VWR) per garantire una distribuzione uniforme.
    5. Eliminare le palle di vetro in 100% EtOH soluzione. Posizionare le piastre LB in un incubatore a 37 ° C durante la notte.
    6. Come passaggio facoltativo, utilizzare un sistema di imaging con luce visiva per ottenere un'immagine delle piastre LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Contare il numero di colonie o sulla stessa piastra o dall'immagine della piastra utilizzando lo strumento conta su Photoshop software (Adobe Photoshop CS3).
    7. Calcolare il numero di unità formanti colonia per volo usando la formula: [N / (N * D * v)] * V, dove n = numero di colonie cresciute sulla piastra LB; N = numero delle mosche riunito in un unico provetta, D = fattore di diluizione, e v = volume della soluzione si diffuse su ogni piatto; V = volume iniziale del omogeneizzato.

4. Valutare sonno e durata di sopravvivenza dopo l'infezione

  1. Permosche che non sono raccolte per misurare carica batterica, continuare a monitorare il comportamento per altri 7-10 giorni. Durata sopravvivenza è influenzata dal genotipo della mosca, condizioni ambientali, e le specie batteriche utilizzate per l'infezione.
  2. Dopo circa 10 giorni, interrompere l'esperimento, scaricare ed elaborare i dati comportamentali come descritto in precedenza 6. Insomniac2 software personalizzato, che si basa in Matlab, viene utilizzato per analizzare i parametri del sonno. È importante eliminare mosche morte dall'analisi comportamentale. Normalmente, questo limita analisi entro il primo giorno dopo l'infezione, a seconda del tipo di infezione e genotipo mosca. Morte nel saggio è indicata dal tempo tutti i conteggi attività arrivato a zero. Per facilitare l'analisi della sopravvivenza, Drosonex, software personalizzato scritto in Microsoft Visual C + + 6.0, viene utilizzato per elaborare file di dati dal sistema DAM Trikinetics. Le relazioni software come file di Excel, la durata di sopravvivenza di ogni volo (in ore), compila attività datuna da tutti i monitor in un foglio singolo, e riporta la percentuale vola sopravvivere nel tempo impostato dall'utente. I file di Excel sono progettati per integrarsi in altri pacchetti software statistici per ulteriori analisi.

5. Misurare l'attività NFκB durante l'infezione usando un saggio Luciferase Reporter

Transgenico kB-luc mosche utilizzato in questa analisi sono stati generati come descritto in precedenza Kuo et al., 2010 2. Brevemente, il kB-luc giornalista contiene 8 ripetizioni di una sequenza NFκB vincolante che sono stati inseriti in un promotore a monte di una cornice di lettura aperta luciferasi.

  1. Regolare mosche alle condizioni di illuminazione sperimentali, come descritto nella sezione 1.2. In questo esempio, 1-4 giorni vecchi kB-luc mosche sono alloggiati in fiale contenenti meno di 5%, 2% agar e terreno alimentare messo in luce costante (LL) per 2 giorni per raggiungere la stessa età di altre mosche durante l'infezione.
  2. Preparare una micropiastra a 96 pozzetti per le mosche. Ogni pozzetto contiene due strati di supporto alimentare (figura 2), lo strato superiore contiene luciferina, il substrato di luciferasi. Aggiungere 300 pl di un 5% di saccarosio, soluzione di agar al 2% in ogni pozzetto e lasciare solidificare. Successivamente, aggiungere un 50 microlitri strato superiore ad ogni saccarosio e contenente il 5%, 1% agar, e 2 mM luciferina (Gold Biotechnology, Inc.). Concentrazioni luciferina utilizzati per attività reporter di misurazione in Drosophila hanno variato in letteratura, e sono stati a partire da 100 pM 13. La concentrazione richiesta può essere determinato empiricamente. Tra gli strati erogazione alimentari, coprire la piastra con un panno maglia fine per facilitare l'asciugatura mantenendo la sterilità. La piastra deve essere permesso di asciugare completamente, fino a un'ora, in modo da evitare che le mosche di rimanere bloccati in goccioline di condensa. Perché luciferina è sensibile alla luce, evitare di esporre le piastre alla luce più del necessario.
  3. Applicare un film trasparente adesivo (Top-Seal-A; Perkin Elmer) ad una piastra da 96 pozzetti micropozzetti e perforare con un ago fine in una quantità di 2 fori per pozzetto. Questi buchi non solo permetterà ricambio d'aria in ogni pozzetto, ma fornirà anche un modo per anestetizzare le mosche su base individuale. Utilizzando una lama affilata e regolo, introdurre un taglio tra ogni colonna. Ciò fornirà un modo semplice per caricare / scaricare mosche in gruppi di 8 alla volta.
    Per caricare mosche nella piastra Elisa, togliere i flaconcini dal termostato e vola anestetizzare un CO 2 pad. Carico vola uno ad uno ad ogni pozzetto colonna per colonna. Se una mosca inavvertitamente si blocca al sigillo adesivo, lasciare al volo da solo in quanto sono spesso in grado di liberarsi senza l'intervento. Riportare la micropiastra per l'incubatrice in LL per 8-24 ore di adattarsi al nuovo ambiente e di consumare il substrato luciferina.
  4. Batteri Cultura, S. marcescens, e preparare una soluzione di infezione come descritto sopra.
  5. Anestetizzare tvola utilizzando una punta micropipetta collegato a una bassa pressione di CO 2 righe. Posizionare la punta della micropipetta direttamente sopra i fori di ventilazione realizzati per ciascun pozzetto. Fare attenzione per assicurare che la pressione di CO 2 è sufficientemente elevata per anestetizzare il volo, ma abbastanza basso per evitare lesioni al volo. In gruppi di otto, singolarmente trasferire ciascun volo a un pad CO 2, e infettare come descritto sopra. Dopo l'infezione, ritornare ogni mosca al suo originale bene e sigillare la micropiastra.
  6. Misura luminescenza (TopCount NXT-Luminescenza e contatore a scintillazione, Perkin-Elmer). Il contatore luminescenza TopCount contiene una cassetta di impilamento dei piatti, che consente per le letture programmate e automatico continuo con incrementi desiderati per un certo periodo di tempo (di solito fino a cinque giorni). Questa funzione non è disponibile su tutti gli strumenti, e la raccolta di dati per esperimenti eseguiti con altri strumenti possono essere quindi meno frequenti. Il contatore luminescenza è alloggiato in un room a temperatura controllata e pianificazione illuminazione. Sistemare i piatti nel cassetto di impilamento, impilare le tavole contenenti le mosche tra chiari lastre vuote per far sì che le mosche ricevere luce. Programmare il luminometro secondo le specifiche del produttore di raccogliere le letture ogni ora per un minimo di 24 ore. In questo esempio, i rilevatori sono programmati per leggere ogni pozzetto per 10 sec e per esprimere il risultato come conteggi (unità arbitrarie) al secondo. Questo valore è una media su 3 letture al bene. Esportare i file di dati in un foglio di calcolo e di eseguire una analisi standard, graficamente i risultati di luminescenza.

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Risultati

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  1. Infezione favorisce il sonno. In questo esempio, Canton-S (CS) mosche wild type e mosche mutanti privi di un gene NFκB, Relish (Rel E20) 14, sono stati caricati in due DAM2 controlla l'attività (n = 32 per ogni genotipo) ed infettati come descritto sopra. Mosche sono stati mantenuti in luce costante per eliminare l'influenza dell'orologio circadiano sul comportamento e infezione 2,7,8. I mutanti sono stati E20 Rel isogenized al CS come descritto in precedenza 11. En...

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Discussione

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Questo protocollo delinea un approccio per studiare come comportamento, particolarmente dormire, è connesso a parametri di risposta immunitaria. Questi parametri includono la carica batterica, esito di sopravvivenza, e l'attività NFκB come misurato da un reporter luciferasi in vivo. Insieme essi danno informazioni su quanto bene una mosca in grado di combattere l'infezione. Carica batterica e dei risultati di sopravvivenza sono parametri di risposta immunitaria che comportano una misura semplice in ...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation in concessione # IOS-1025627 e dal National Institutes of Health in concessione # 1R21NS078582-01 a JAW

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del materiale Azienda Numero di catalogo Commenti
Attrezzatura
Incubatori Percival Scientific, Inc. I30BLLC8
I36VLC8 		Ogni incubatore in grado di eseguire luce programmato / orari di temperatura è appropriato.
Drosophila attività il Monitor Trikinetics Inc., Waltham, MA DAM2 Come descritto altrove 6, questo sistema richiede un interfaccia con il computer, il software e altri accessori.
Tubi di vetro Pyrex Trikinetics Inc., Waltham, MA PGT-5x65
Micropiastre scintillazione e contro luminescenza Perkin Elmer TopCount NXT
12 Rilevatore 		Qualsiasi micropiastre in grado di rilevare luminescenza può essere utilizzato per questo tipo di saggio reporter. TopCount contiene rivelatori multipli e un impilatore automatico, è in grado di essere programmato per leggere continuamente da piastre multiple.
FluorChem 8900 Alpha Innotech Imaging di colture batteriche è facoltativo; qualsiasi sistema di imaging digitale con capacità di luce visibile è sufficiente.
Micropipetta Puller Tritech Research, Inc. Narishige PC-10
Forniture
Vetro borosilicato Capillari Mondo Precision Instrument Inc. 1B100F-4
3 ml Siringa Fisher Scientific BD 305482
Aghi per siringhe Fisher Scientific BD 305196 G 18 - tagliare la punta dell'ago per evitare di danneggiare il tubo.
Tubo in silicone, id (0,030 ") od (0,065") Spessore parete (0.018 ") VWR 60985-706 Usato per fissare aghi capillare di vetro ad una siringa
Rubinetto a 3 vie Azienda americana Pharmaseal K75
Kontes pellet Pestello motore a batteria Fisher Scientific K749540-0000
Kontes pellet Pestello Fisher Scientific K749521-1590
Palle di vetro da 3 mm VWR 26396-630
Micropiastre Microlite 1 + Thermo Scientific 7571 Select piastre da 96 pozzetti che sono appropriati per luminescenza - devono essere opachi.
TopSeal-A :96-pozzetti PerkinElmer 6005185 Micropiastre Press-On Film di tenuta adesiva
D-Luciferin, sale di potassio Oro Biotechnology, Inc. Lucna
Software
Insomniac2 Disponibile su richiesta agli autori personalizzato, scritto da Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) Matlab software basato che è stato utilizzato per l'analisi di routine del sonno 2,6,11
Drosonex Disponibile su richiesta agli autori personalizzato, scritto da Thomas Coradetti (Software Sidewalk) Un MSVC6 programma per PC utilizzato per l'analisi della sopravvivenza da file di dati grezzi raccolti con laTrikinetics sistema
Photoshop CS3 Adobe Utile per ottenere il numero di ufc / piastra da immagini digitali (opzionale)

Riferimenti

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