Isolamento di cellule melanociti-come primario dal Cuore del mouse

Sommario

In questo protocollo, w e identificato una popolazione romanzo di cellule melanociti-simile (anche conosciuto come melanociti cardiaci) nel cuore dei topi e gli esseri umani che contribuiscono ad aritmia atriale provoca nei topi.

Abstract

Abbiamo identificato una popolazione romanzo di cellule melanociti-simile (anche conosciuto come melanociti cardiaci) nel cuore dei topi e gli esseri umani che contribuiscono a trigger di aritmia atriale nei topi. Per studiare le proprietà elettriche e biologiche dei melanociti cardiaci abbiamo sviluppato una procedura per isolarli dai cuori di topo che derivati ​​da quelli progettati per isolare cardiomiociti murini neonatali. Al fine di ottenere melanociti cardiache sane adatte per una più ampia patch clamp o studi biochimici, abbiamo sviluppato una procedura raffinata per isolare e placcatura melanociti cardiaci basati su quelli originariamente progettato per isolare melanociti cutanei. La procedura raffinata è dimostrato in questa recensione e produce un numero maggiore di cellule melanociti-come sani che può essere placcato come una popolazione pura o con cardiomiociti.

Introduzione

Abbiamo recentemente identificato una popolazione di cellule romanzo nel cuore di topi e gli esseri umani che esprimono enzimi melanina-sintesi e morfologicamente assomigliano melanociti cutanei. Abbiamo chiamato 'melanociti cardiaci' queste cellule e l'ho trovato sono presenti in posizioni anatomiche da cui aritmia atriale trigger spesso origine negli esseri umani. Abbiamo anche trovato melanociti cardiaci contribuiscono ad aritmie atriali nei topi con delezione linea germinale di Dct. Melanociti cardiache sono scarsamente distribuiti in tutto l'atrio del mouse dove essi costituiscono meno dello 0,1% di tutte le cellule atriali. Per studiare le proprietà elettriche e biologiche dei melanociti cardiaci abbiamo sviluppato una procedura per isolarli dal cuore mouse utilizzando marcatori specifici melanociti Cre-inducibile. La nostra procedura iniziale è stato sviluppato da quelli utilizzati per isolare cardiomiociti murini neonatali e fruttate molto piccolo numero di cellule adatti per le registrazioni di patch clamp o analisi PCR. Tuttavia, per migliorare la guarigioneesima e la vitalità dei melanociti cardiaci, per più approfondita analisi elettrofisiologica o studi biochimici, abbiamo sviluppato una procedura raffinata da quelli progettati per isolare melanociti cutanei. La procedura descritta e dimostrata in questa recensione ha il vantaggio di produrre sani melanociti cardiaco che può essere placcato come una popolazione pura o con cardiomiociti.

Protocollo

1 Preparare le soluzioni necessarie e attrezzature

1. In primo luogo, sterilizzare gli strumenti chirurgici (pinze diritte forma, pinze forma curva, forbici forma diritta, e forbici forma curva) da loro autoclave per 15 min. a 121 ° C. Preparare 2 set di strumenti, in cui viene utilizzato un set per sezionare i cuori e l'altro insieme saranno utilizzati per tritare il tessuto.
2. Sciogliere 1 bustina di MCDB153 cultura media in 900 ml di sterile, acqua filtrata e mescolare lentamente fino a che la polvere si è sciolta. Aggiungere 1,2 g di bicarbonato di sodio, o 15,7 ml di soluzione di bicarbonato di sodio [7,5% w / v], per ogni litro di volume finale di soluzione in fase di preparazione e mescolare fino alla dissoluzione. Regolare il pH a 7,2 aggiungendo o 1 N HCl o NaOH 1 N, quindi versare i media attraverso un filtro 0,2 micron top bottiglia in condizioni di sterilità in una cappa coltura tissutale (cabinet biosicurezza). Poi raccogliere i media e conservarlo a 4 ° C.
3. Preparare i supplementi aiaggiungere al terreno di coltura (Elenco materiali). Gli integratori devono essere aggiunti ai media poco prima è necessario il supporto per la placcatura le cellule.
4. Preparare DPBS con 10% FBS più antibiotici (penicillina e streptomicina).
5. Avanti, preparare una soluzione di tripsina 0,25% con l'aggiunta di 0,25 g di tripsina (pancreas bovino, attività> 2.500 unità USP / mg, ultrapura, USB) a 100 ml di DPBS più antibiotici (penicillina e streptomicina).
6. Altre apparecchiature necessarie necessaria per completare questa procedura includono uno stereomicroscopio, Petri-piatti (10 cm), tubi conici da 50 ml, filtri cellulari 40-micron, DPBS più antibiotici, 60 mm piatti della cultura e da 35 mm piatti della cultura.

2 Isolare Cuori da neonatali mouse Pups

1. In primo luogo, ottenere P0 a P2 cuccioli di topo neonatale (n = 6 a 8). Si consiglia di utilizzare cuccioli generati da allevamento DCT-Cre femmine omozigoti con i maschi che sono eterozigoti per entrambi il R26R: EYFP allele o Z / EG allele per etichettare l'cellule melanociti-like. Entrambi R26R: EYFP e Z / EG topi sono disponibili da Jackson Laboratories (numeri azionari 006.148 e 003.920 rispettivamente).
2. Avanti, eutanasia neonatale i cuccioli di topo, pulire il petto con un batuffolo imbevuto di alcool e poi mettere i cuccioli in un cm 10 Scatola di Petri con DPBS.
3. Tagliare la pelle sul petto e lo sterno con le pinze e forbici sterilizzate e poi aprire con cautela il petto sotto uno stereomicroscopio. I cuori di cuccioli neonati di topo sono molto piccole quindi fate attenzione a fare in modo di rimuovere l'intero cuore con gli atri allegate.
4. Lavare i cuori in DPBS e trasferirli in un nuovo piatto di Petri di 10 cm.

3 Digestione enzimatica

1. Portare la piastra di Petri con il cuore asportato ad una cappa di coltura tissutale (cabinet biosicurezza) e poi seguire le istruzioni riportate di seguito utilizzando tecniche sterili nella cappa.
2. In primo luogo, lavare i cuori per tre volte in DPBS sterili, più antibiotici.
3. Posizionare i cuori (n = 6-8) in un60-mm piatto di coltura e aggiungere 6-8 ml di soluzione di tripsina allo 0,5% al ​​piatto.
4. Quindi, tagliare i cuori in piccoli pezzi (meno di 1 mm di dimensioni) e incubare a 37 ° C per 30 minuti in una atmosfera di CO ₂ 5%.
5. Dopo il periodo di incubazione è completa, versare la soluzione risultante di tessuto cardiaco e tripsina dal piatto in un tubo conico da 50 ml sterile.
6. Poi, usando una pipetta sterile da 10 ml, rapidamente ma delicatamente, triturare la soluzione nel tubo conico da 50 ml 30-50 volte.
7. Filtrare la soluzione attraverso un filtro cella 40 micron sulla cima di una nuova pulita tubo conico da 50 ml, per raccogliere il filtrato.
8. Successivamente, centrifugare la provetta da 50 ml a 240 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min a temperatura ambiente. Poi, delicatamente Aspirare il sopranatante e risospendere il pellet residuo in 6-8 ml di DPBS sterili. Ripetere questa operazione altre 2 volte. Questo passaggio Pellet miociti atriali e melanociti cardiache, ma non far cadere il fifibroblasti in quanto i fibroblasti sono più piccole e rimarranno nel surnatante.

Celle 4 placcatura cardiaca melanocita-like

1. Dopo il terzo risciacquo dopo la centrifugazione, scarico con attenzione o aspirare al largo della soluzione di lavaggio (DPBS) e risospendere il pellet in 6 ml di terreni di coltura MCDB a cui sono stati aggiunti i supplementi.
2. Ora, disegnare la soluzione risospeso in una pipetta di trasferimento sterile e posizionare le cellule in un piatto da 35 mm, o in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti, e in comune le cellule cardiache isolate da 3 topi neonati in un piatto da 35 mm o bene.
3. Incubare i piatti per una notte a 37 ° C in atmosfera di CO ₂ 5%, aspirare fuori dal terreno di coltura insieme a tutte le cellule non attaccati e poi sciacquare le piastre una volta con DPBS. Quindi aggiungere mezzi freschi per le piastre e sostituire i media ogni 2 giorni. Le cellule isolate da cuori neonatale o embrionali possono essere mantenuti in coltura per fino a 3 settimane, mentre le cellule isolate da sentire adultots possono essere mantenute in coltura per un massimo di 10 giorni.

Cellule 5. isolamento Cardiac melanocita-come da Cuore topo adulto

1. In primo luogo, rimuovere i cuori di topi maturo (3-4 settimane di età, n = 3) attraverso una sternotomia linea mediana dopo somministrazione di eparina 100 U intraperitoneale ai topi e poi li eutanasia. Si consiglia di utilizzare pentobarbital di eutanasia topi per questa procedura, ma questo farmaco non è disponibile in tutte le località.
2. Successivamente, lavare i cuori asportati in DPBS sterili contenenti antibiotici in una cappa coltura tissutale (cabinet biosicurezza). Spremere il cuore leggermente con dissettore curve per rimuovere il sangue residuo da loro e poi sciacquare i cuori in DPBS ancora una volta.
3. Rimuovere gli atri e anello atrioventricolare dal cuore (queste strutture contengono le cellule melanociti-like) e posizionare i campioni di tessuto asportato in un piatto da 35 mm.
4. Tagliare i cuori in piccoli pezzi con le forbici curve e forzaps e poi aggiungere 6-8 ml di soluzione di tripsina allo 0,5% al ​​piatto. Poi incubare le piastre a 37 ° C per 45-60 min.
5. Ora, seguire i passaggi della procedura di cui sopra a partire dal punto 3.6 in poi.

Risultati

Il protocollo descritto in questo articolo è una tecnica migliorata rispetto a quella che abbiamo già pubblicato per isolare melanociti cardiache dal cuore murino. Questa procedura impiega l'uso di marcatori fluorescenti guidati da sintesi della melanina specifica-enzima Cre-ricombinasi di etichettare cellule melanociti-simile cardiaci. E 'importante utilizzare un marcatore per etichettare melanociti cardiaci quando si lavora con le cellule embrionali o neonatali appena isolate, dal momento che le differenze mor...

Discussione

Melanociti cardiache sono presenti in sedi anatomiche all'interno del cuore che spesso danno luogo a trigger aritmie atriali. Queste regioni comprendono le vene polmonari, l'anello atrioventricolare, posteriore sinistra dell'atrio e del forame ovale (Figura 4). Per comprendere il ruolo di queste cellule svolgono in aritmogenesi, sviluppiamo tecniche per isolare loro e studiare la loro fisiologia. Tuttavia, abbiamo riconosciuto che il miglioramento di questa tecnica a cedere quantitativi più ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	Sciogliere in acqua
DPBS, senza calcio né magnesio	Invitrogen	14190136	Conc. di stock: 1x Conc. di lavoro: 1x
Penicillina-streptomicina	Invitrogen	15140163	Conc. di stock: 100x Conc. di lavoro: 1x
Serum Fetale Bovino	Life Technology	Certificato	Conc. di lavoro: 4%
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	Sciogliere in DMSO Conc. di stock: 3,2 μM Conc. di lavoro: 32 nM
Transferrina	Sigma-Aldrich	T8158	Sciogliere in DPBS Conc. di stock: 0,1 mg/ml Conc. di lavoro: 1 μg/ml
AMP ciclico dibutirrico	Sigma-Aldrich	D0627	Sciogliere in DPBS Conc. di stock: 0,5 mM Conc. di lavoro: 5 μM
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634	Sciogliere in acido acetico 10 mM Conc. di stock: 1 mg/ml Conc. di lavoro: 5 μg/ml
FGF basico	BD Biosciences	354060	Sciogliere in acqua Conc. di stock: 4 ng/μl Conc. di lavoro: 4 ng/ml