Articolo metodologico

Un nuovo metodo per la Cultura e polarizzata stimolazione umani espianti mucosa intestinale

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DOI:

10.3791/4368

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1 maggio 2013

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1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, European Institute of Oncology, 3U.O. Gastroenterologia 2, IRCCS Ca' Granda, Ospedale Policlinico di Milano

In questo articolo

Sommario

Si introduce un nuovo metodo per il mantenimento della mucosa intestinale umana in coltura e monitoraggio della risposta a vari tipi di stimoli per almeno 24 ore. Con il nostro metodo, la polarità del tessuto sia conservato, consentendo una stimolazione fisiologica per via apicale.

Abstract

Pochi modelli attualmente esistenti per simulare realisticamente micro-ambiente del complesso di intestino umano, dove una varietà di interazioni hanno luogo. Omeostasi corretta dipende direttamente queste interazioni, come egli si forma un intero risposta immunologica indurre tolleranza contro antigeni alimentari, mentre allo stesso tempo di montaggio risposte immunitarie efficaci contro microbi patogeni ingeriti accidentalmente con il cibo.

Omeostasi intestinale è preservata anche attraverso varie complesse interazioni tra il microbiota (compreso cibo-associati ceppi batterici utili) e l'host, che regolano il fissaggio / degradazione del muco, la produzione di peptidi antimicrobici attraverso la barriera epiteliale, e la "istruzione" di cellule epiteliali 'che controlla il fenotipo tollerogenica o immunogenica di, unico budello residenti cellule linfoidi' popolazioni. Queste interazioni sono state finora molto difficile da riprodurre con saggi in vitroutilizzando sia linee cellulari coltivate o cellule mononucleari del sangue periferico. Inoltre, modelli murini differiscono sostanzialmente per componenti della mucosa intestinale (organizzazione strato di muco, batteri commensali comunità) rispetto nell'intestino umano. Così, gli studi di una varietà di trattamenti per essere portati nelle cliniche per le condizioni legate allo stress o patologiche importanti come la sindrome dell'intestino irritabile, malattie infiammatorie intestinali o il cancro del colon-retto sono stati difficili da realizzare.

Per affrontare questi problemi, abbiamo sviluppato un nuovo sistema che ci permette di stimolare espianti di mucosa intestinale umana che conservano la loro in situ condizionata dal microbiota dell'ospite e la risposta immunitaria, in modo polarizzato. Stimolazione apicale polarizzata è di grande importanza per l'esito della suscitato risposta immunitaria. E 'stato ripetutamente dimostrato che gli stessi stimoli possono produrre risposte completamente diverse quando bypassare la faccia apicale della epi intestinalethelium, stimolando le cellule epiteliali basolaterally o di contatto diretto con componenti lamina propria, passando il fenotipo da tollerogenico a immunogenica e causando infiammazione inutile ed eccessivo delle superfici.

Abbiamo ottenuto stimolazione polarizzata incollando un cilindro grotta che delimita la zona di stimolazione sulla faccia apicale della mucosa, come sarà descritto nel protocollo. Abbiamo utilizzato questo modello per esaminare, tra l'altro, gli effetti differenziali di tre diversi ceppi di lattobacilli. Mostriamo che questo modello di sistema è molto potente per valutare le proprietà immunomodulanti di probiotici in condizioni di buona salute e di malattia.

Protocollo

1. Raccogliere ed elaborare i Tissue

  1. Tissutale (sano o IBD mucosa) è ottenuto durante la chirurgia. Una volta che il campione è escisse trasferimento al laboratorio non appena possibile, mantenendolo in Ca + + / Mg + + tampone HBSS privo integrato con Pen / Strep a 4 ° C o su ghiaccio.

* La dimensione del campione dipende dalla disponibilità del tessuto: la parte del tessuto ottenuto, è rigorosamente quello che non serve per la diagnosi e può variare notevolmente tra soggetti sani e IBD. Tessuto sano è asportato da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per tumore del colon.

  1. Lavare il tessuto con delicatezza e pulirlo di tutto il materiale mesenterica. Separare lo strato di mucosa dalla sottomucosa usando forbici e pinze sterili mantenendo il tessuto in tampone HBSS in una capsula Petri (non necessariamente immerged). Toccare la superficie della mucosa con le pinze il meno possibile.
  2. Tagliare mucosa in strisce di almeno 1 cm di larghezza e più a lungo possibile. Utilizzare due bisturi sterili, tanto come se si stesse tagliando il cibo.
  3. Lavare pulire mucosa delicatamente in HBSS ed estenderla in una capsula di Petri con la parte apicale rivolta verso l'alto.

2. Montaggio del Tissue

  1. Preparare mezzo fresco (tisDMEM). Utilizzare DMEM integrato con glutammina (2 mM) e NaPyr (1 mm) e aggiungere il 15% FBS-Na (Fetal Bovine Serum - Nord America), 1% ITS-X e 200 ng / ml di EGF al momento dell'uso.
  2. Riempire un piatto di 10 cm di Petri con il resto della FBS-Na (utilizzare circa 30 ml modo che reti metalliche saranno completamente sommersi) ed immergere le griglie metalliche. Mantenere la piastra di aprire e sostenere i cilindri di plastica sul suo rubinetto.

* Le griglie metalliche sono in ferro. La maglia è di forma quadrata con un lato di 0,5 mm.

  1. Prendere 3 ml di colla chirurgica con un 10 o 20 microlitri pipetta. Applicare con attenzione ad uno dei confini di un cilindro di plastica tenendolo FIRM con le pinze.
  2. Posizionare delicatamente il cilindro sul lato apicale della mucosa, il più vicino ad uno dei bordi della striscia il più possibile.
  3. Per dare il tempo colla per attaccare saldamente il cilindro sul tessuto, preparare la piastra organo cultura centro-well: Pipettare 850 ml-1 ml di mezzo in centro ben e sostenere la griglia metallica sui bordi ben centrale della piastra.
  4. Tagliare il tessuto in eccesso dai bordi del cilindro con due bisturi sterili come prima.
  5. Sollevare delicatamente il cilindro con il tessuto allegato e posizionare il lato basolaterale in griglia metallica al centro della piastra.

3. Stimolazione

  1. Utilizzare gli stimoli della vostra scelta nella vostra concentrazione preferita.
  2. Applicare volume appropriato nel centro del cilindro di plastica senza disturbare il cilindro o la superficie mucosa con la punta della pipetta. Assicurarsi che il volume prescelto copre uniformemente la superficie interna del cilindro. InVolumi dicata:
    Grande plastica cilindro: 200 pl
    Mezzo cilindro di plastica: 100 ml
    Piccolo cilindro di plastica: 50 ml
  3. Incubare fino a 3 ore in un incubatore convenzionale.

* Se si desidera incubare per intervalli di tempo più lunghi, assicurarsi di utilizzare un volume molto più piccolo di stimoli (10-20 ml) e inserire direttamente il tessuto in una atmosfera di 100% O 2 nella pressione di 1 atm (vedi 3.5) .

  1. Prendete il medium con gli stimoli al largo della superficie apicale del tessuto e non sostituiscono con terreno fresco, perché il tessuto non riceve abbastanza O 2 se uno spesso strato di medio sulla faccia apicale impedisce lo scambio di gas. Coprire la piastra.
  2. Posizionare il tessuto in una atmosfera di 100% O 2 nella pressione di 1 atm.

4. Fare la raccolta

  1. Dopo 24 ore di tempo di cultura totale (± 2,5 ore), rimuovere con attenzione il cilindro da thtessuto e con l'aiuto di un bisturi colla raschiando delicatamente e conservarla in base all'analisi desiderata (fissa per immunoistochimica e / o test di immunofluorescenza, o congelare a scatto in N2 liquido per RNA purificazione e profilo di espressione genica o purificazione di proteine ​​e saggi di Western Blot ).
  2. Raccogliere il medium basolaterale per secrezione di citochine profiling. Centrifugare a 8000 rpm per 7 minuti per far sedimentare i detriti, trasferire il surnatante in una provetta Eppendorf (in alternativa aliquota) e subito conservare a -20 ° C.

* Se si desidera mantenere surnatanti più a lungo, conservarli a -80 ° C.

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Risultati

Siamo riusciti a mantenere la mucosa intestinale umano sano e IBD in coltura per almeno 24 ore preservare il benessere del tessuto. In conformità con le precedenti osservazioni 1, questo era possibile solo se la maggior parte del tempo di coltura (almeno il 85% del totale) è avvenuta in O 2, come il tessuto non è sopravvissuto per 24 h in incubatori convenzionali (Figura 2). Abbiamo anche dimostrato che differenti risposte dei espianti possono essere osservati su questo modello a s...

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Discussione

La necessità di modelli fisiologicamente rilevanti su cui i trattamenti per mucosa intestinale umana possono essere validamente testati è stato a lungo enfatizzato. Molti ricercatori hanno identificato potenziali artefatti e difetti in entrambe cella 5 e 6 modelli di topo finora utilizzato per tale scopo. Infatti, anche se i dati preclinici promettente è spesso ottenuti, questi raramente si traducono in un beneficio clinico significativo.

Il metodo descritto in questo l...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Ringraziamo Erika Mileti per un eccellente supporto tecnico e il Dott. Antonio Di Sabatino per fornire alle camere di ossigeno.

Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del 7 ° programma quadro dell'UE (IBDase, ERC: Dendroworld) e Fondazione Cariplo per MR e sostegno da parte di una rete internazionale Marie Curie di formazione alla mobilità (Cross-Talk, Grant Agreement n: 21.553-2) a KT.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
HBSS 10XEurocalneECM4006XL
Peni/StreptoLonzaDE17602E
GentamicinaGibco15750-037
DMEMLonzaBE12614
FBS-NaGibco16000-044
ITS-X 100XGibco51500-056
EGFTebu-bio100-15
L-GlutamminaLonzaBE17605E
Aminoacidi non essenziali 100XGibco11140-035
NaPyrGibco11360-039
Materiali
Cilindri di clonaggio 6x8 mmBellCo2090-00608
Cilindri di clonaggio 8x8 mmBellCo2090-0080
Cilindri di clonaggio 10x10 mmBellCo2090-01010
Griglie metallicheFatte in casa
Piastra per coltura organica con pozzetto centraleBD Falcon353037
Colla chirurgica (Vetbond)3M1469SB
Vasi per ossigenoFatti in casa
Contenitori per ossigenoAir Liquid Sanità

Riferimenti

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Coltura tissutaleanalisi dei probioticieffetti immunomodulatorisecrezione di citochineimmunoistochimicaambiente ricco di ossigenostimolazione della superficie apicalericerca sulle IBD

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