Spunti olfattivi mediare molti differenti comportamenti in insetti, e sono spesso miscele complesse costituite da decine a centinaia di composti volatili. Mediante gascromatografia con registrazione multicanale nel lobo insetto antennale, si descrive un metodo per l'identificazione di composti bioattivi.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Identificazione dei volatili olfattive utilizzando la gas cromatografia-Multi-unit Recordings (GCMR) nel lobo antennale Insetto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tutti gli organismi vivono in un mondo pieno di stimoli sensoriali che determinano la loro risposta comportamentale e fisiologica al loro ambiente. Olfatto è particolarmente importante negli insetti, che utilizzano i loro sistemi olfattivi di rispondere, e discriminare tra odori, stimoli complessi. Questi odori sollecitare comportamenti che mediano i processi come la riproduzione e la selezione dell'habitat 1-3. Inoltre, il rilevamento chimico di mediare insetti comportamenti che sono di grande importanza per l'agricoltura e la salute umana, compresa l'impollinazione 4-6, erbivori delle colture alimentari 7, e la trasmissione di malattie 8,9. Identificazione dei segnali olfattivi e il loro ruolo nel comportamento degli insetti è quindi importante per capire sia i processi ecologici e le risorse di cibo umano e il benessere.
Ad oggi, l'identificazione di sostanze volatili che guidano il comportamento degli insetti è stato difficile e spesso noioso. Le tecniche attuali sonogas cromatografia-coupled registrazione electroantennogram (GC-EAG), e gas cromatografia accoppiata singole registrazioni sensillum (GC-SSR) 10-12. Queste tecniche rivelato fondamentale per l'identificazione di composti bioattivi. Abbiamo messo a punto un metodo che utilizza la gascromatografia accoppiata a multicanale registrazioni elettrofisiologiche (definito 'GCMR') dai neuroni nel lobo antennale (AL; principale centro olfattivo degli insetti) 13,14. Questo stato-of-the-art tecnica permette di sondare come informazioni odore viene rappresentata nel cervello insetto. Inoltre, poiché le risposte neurali agli odori a questo livello di elaborazione olfattiva sono causa molto sensibili al grado di convergenza dei neuroni recettori dell'antenna in neuroni AL, AL registrazioni permetterà di costituenti attivi di odori naturali efficiente e con elevata sensibilità. Qui descriviamo GCMR e dare un esempio del suo utilizzo.
Diversi passaggi generali sono coinved nella rilevazione di sostanze volatili bioattivi e risposta insetti. Volatili necessario prima di essere raccolti da fonti di interesse (in questo esempio si usa fiori dal genere Mimulus (Phyrmaceae)) e caratterizzata, se necessario utilizzando le normali tecniche di GC-MS 14-16. Insetti sono preparati per studio utilizzando dissezione minima, dopo di che un elettrodo di registrazione viene inserito nel lobo antennale e multi-canale neurale inizia. Post-processing dei dati neurali poi rivela che odori particolari causare notevoli risposte neurali del sistema nervoso degli insetti.
Anche se l'esempio che presentiamo qui è specifico per gli studi di impollinazione, GCMR può essere estesa ad una vasta gamma di organismi di studio e fonti volatili. Per esempio, questo metodo può essere utilizzato per l'identificazione di odoranti attrarre o respingere insetti vettori ei parassiti delle piante. Inoltre, GCMR può anche essere utilizzato per identificare attrattivi per gli insetti benefici, come Pollinators. La tecnica può essere estesa a soggetti non-insetti pure.
Protocollo
1. Follection volatile
- In questo esempio, usiamo campioni volatili da M. fiori lewisii - un nativo alpino wildflower in California. Volatili vengono raccolti con metodi dinamici di assorbimento secondo Riffell et al. 14. In breve, questo metodo impiega un sistema di condensazione ad anello chiuso in cui sono racchiusi i fiori in un sacchetto di Teflon. Utilizzando una pompa a vuoto inerte, l'aria intorno ai fiori viene aspirata attraverso una "trappola" composto da una pipetta Pasteur riempito con Porapak Q matrice. L'aria di ritorno dalla pompa viene filtrata dal carbone attivo. Dopo un periodo di tempo prescr....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Nel saggio GCMR utilizzando il M. lewisii profumo floreale, abbiamo iniettare 3 ml di estratto nel GC. Il numero totale di sostanze volatili di eluizione attraverso il GC è in genere 60-70 volatili. Il profumo di M. lewisii è prevalentemente composta monoterpenoids, compresi β-mircene (aciclico) e α-pinene, con il resto del profumo composto di sei atomi di carbonio volatili, come 2-esanolo e sesquiterpenoidi che compongono <1% di spazio di testa.
GCMR s.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Insetti olfatto-mediate comportamenti guidare molti processi diversi, tra cui la riproduzione, host-selezione del sito, e l'individuazione di risorse alimentari adeguate. Lo studio di questi processi richiede la capacità di identificare i composti volatili emessi dalla sorgente, così come la capacità di identificare i composti che vengono mediano i comportamenti. A complicare le cose è che gli odori sono costituiti da decine a centinaia di singoli composti che insieme creano un profumo unico che viene percepito dive.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da NSF concedere IOS 1121692, e dalla University of Research Foundation di Washington.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome della voce | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Porapak Tipo Q 80-100 maglia | Waters | WAT027060 | |
| Reynolds Forno Borse | Reynolds | ||
| GC | Agilent | 7820A | |
| GC colonna | J & W Scientific, Folsom, CA, USA | DB-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 micron) | |
| Analitica elio gas di trasporto | Praxair | HE K | 1 cc / min |
| 16-canale di silicio elettrodo | NeuroNexus Techndologie | a4x4-3mm50-177 | |
| Filo NiCr Bene, 0,012 mm di diametro) | Sandvik Kanthal HP Reid | PX000004 | Per fare tetrodi personalizzati e stereotrodes |
| Pre-amplificatore | Tucker-Davis sistema | PZ-2 | |
| Amplificatore | Tucker-Davis sistema | RZ-2 | |
| Sistema di acquisizione dati - OpenEx Suite | Tucker-Davis sistema | ||
| Online spike-ordinamento software - SpikePac | Tucker-Davis sistema | ||
| Offline spike-ordinamento software - Mclust Spike-ordinamento toolbox | David Redish, Dipartimento di Neuroscienze, Universitàdel Minnesota | Download gratuito a http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html | Toolbox MATLAB |
Riferimenti
- Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
