Articolo metodologico

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

30.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/4418

⸱

26 novembre 2012

 ,  , 
1Neuroglial Interactions in Cerebral Physiopathology, Center for Interdisciplinary Research in Biology, CNRS UMR 7241, INSERM U1050, Collège de France, 2Paris Diderot University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La preparazione di fettine cerebrali acute di ippocampo isolato, così come le registrazioni elettrofisiologiche simultanee di astrociti e neuroni in Strato radiatum Durante la stimolazione di Schaffer collaterali è descritto. L'isolamento farmacologica di potassio astrogliale e correnti trasportatore del glutammato è dimostrata.

Abstract

Gli astrociti formano insieme con le sinapsi dei neuroni tripartite, in cui integrare e modulare l'attività neuronale. In effetti, gli astrociti sentire ingressi neuronali attraverso l'attivazione dei loro canali ionici e recettori dei neurotrasmettitori, ed elaborare le informazioni in parte attraverso attività-dipendente rilascio di gliotransmitters. Inoltre, astrociti costituiscono il sistema principale di assorbimento per glutammato, contribuiscono al potassio buffer spaziale, nonché alla clearance GABA. Queste cellule quindi costantemente monitorare l'attività sinaptica, e in tal modo sono indicatori sensibili per alterazioni sinapticamente glutammato rilasciato, i livelli di potassio e GABA extracellulare. Inoltre, alterazioni dell'attività assorbimento astrogliale o capacità tampone può avere effetti gravi sulle funzioni neuronali, e può essere trascurato quando caratterizzare situazioni fisiopatologiche o topi knockout. Doppia registrazione delle attività neuronali e astrogliale è quindi un metodo importante per studiare alterazioniforza sinaptica associata al concomitante cambiamenti di assorbimento e capacità di buffering astrogliale. Qui si descrive come preparare fettine di ippocampo, modalità di identificazione strato astrociti radiatum, e come per registrare le risposte elettrofisiologiche neuronali e contemporaneamente astrogliale. Inoltre, si descrive come isolare le correnti farmacologicamente sinapticamente-evocati astrogliali.

Protocollo

1. Preparazione del liquido cerebrospinale artificiale e soluzione intracellulare

  1. Prima di iniziare l'esperimento, si deve preparare la soluzione interna per registrazioni clamp la patch, così come il fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) per la preparazione ippocampo. Avrete inoltre bisogno di un kit composto da dissezione forbice chirurgica e fine forbice iris, due spatole e pinze (strumenti per le scienze Arti), un dispositivo di emissione di gas di vetro (micro-filtro candela, ROBU Germania) e griglia di tessuto (zanzariera o nylon stretto), così come colla (Dent Uhu). La configurazione del setup cerotto fetta elettrofisiologia è stato descritto da Finkel & Bookman, 2001 1.
  2. Per la soluzione interna, sciogliere (in mM): 105 K-gluconato, KCl 30, 10 HEPES e EGTA 0,3 in acqua deionizzata (nel 70-80% del volume finale). Raffreddare la soluzione a 4 ° C e aggiungere (in mM): 4 Mg-ATP, GTP-Tris 0,3 e 10 fosfocreatina. Regolare il pH a 7,4 con KOH e riempimento up con acqua deionizzata per il volume finale. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filtrare la soluzione (dimensione dei pori 0,2 micron). Aliquotati soluzione è stabile per 3-4 settimane a - 20 ° C. Per un giorno sperimentale, ~ 1 ml di soluzione interna è necessaria.
  3. Se non diversamente indicato, il ACSF usato per la preparazione ippocampo e registrazioni di cellule nella regione CA1, contenente (in mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, CaCl 2 2,5, 1,3 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 26,2 NaHCO 3 e 11 glucosio. Sciogliere questi sali in acqua deionizzata (Osmolarità ~ 320 mOsm) e ossigenare la soluzione per almeno 10 minuti (pH ~ 7,3-7,4) con CarboGen (95% O 2 e il 5% di CO 2). Preparare almeno 1 litro di soluzione per esperimento. Particolare cura deve essere presa per la preparazione di tessuto dell'ippocampo che verrà utilizzato per eseguire esperimenti nella regione CA3 dell'ippocampo. Infatti, questa regione è soggetta a epilettiformi attività e successiva morte neuronale. Così SYNAPTattività IC deve essere fortemente ridotta durante la preparazione fetta, e questo si ottiene eseguendo la dissezione dell'ippocampo in ghiacciata soluzione di saccarosio contenente (in mM): NaCl 87, 2,5 KCl, CaCl 2 0,5, 7 MgCl 2, 1 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 e 75 Saccarosio Glucosio. In questa soluzione, la combinazione di sodio bassa, bassi livelli di calcio e magnesio concentrazioni elevate massicciamente ridurre cottura presinaptica e probabilità di distacco, nonché postsinaptica attività del recettore NMDA, minimizzando attività spontanea e la morte cellulare. Una volta preparata, fettine ippocampali utilizzati per registrazioni di cellule della regione CA3 vengono perfuse con ACSF modificato, contenente 4 mM CaCl 2 e 4 MgSO 4, per ridurre al minimo l'attività polisinaptici.

2. Acuta Preparazione Slice ippocampale

  1. Raffreddare ~ 300 ml di ACSF per la camera di taglio, così come per la preparazione a 4 ° C, mentre costantemente ossigenante conCarboGen. Preparare un piccolo becher con ACSF a temperatura ambiente (RT) per la memorizzazione slice, che è anche ossigenato con carbogeno (Schema Figura 1).
  2. Anestetizzare il mouse sotto una cappa con un tovagliolo di carta imbevuto piccola con 1 ml di isoflurano che viene aggiunto nella gabbia.
  3. Dopo che il mouse è profondamente anestetizzato, tagliare la testa e inserirlo direttamente in un piccolo piatto con ghiacciata ACSF ossigenato. Rimuovere il cuoio capelluto con una piccola forbice e trasferire la testa sul tessuto per le fasi successive. Iniziare a sezionare l'ippocampo, come illustrato e descritto in Figura 1.
  4. Tagliare 300-400 micron fette trasversali a bassa velocità (3 micron / sec) e la frequenza di vibrazione di 70 Hz a freddo ghiaccio ossigenato ACSF, e trasferirli in una camera di stoccaggio. Lasciare riposare le fette a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima della registrazione. Fette per CA3 esperimenti sono memorizzati 25 min a 34 ° C e almeno 30 min a RT, per recuperare dal processo di taglio.

3. Doppia registrazione di Evocati Correnti astrogliale e potenziali di campo neuronali

Noi qui viene descritto come registrare sinapticamente-evocato risposte astrogliali e neuronale, vale a dire le risposte indotte dalla attivazione delle sinapsi attraverso la stimolazione afferenza utilizzando un elettrodo extracellulare.

  1. Costantemente perfondere camera di registrazione con ACSF ossigenato (1,5-2 ml / min, RT), contenente 100 mM picrotossina (GABA A antagonista) per isolare risposte eccitatorie. Trasferire una fetta su un poli-L-lisina (1,5 a 3 mg / ml) coprioggetto rivestiti, immergere il liquido per ottenere una buona adesione fetta e aggiungere una goccia di ASCF sopra della fetta. Posizionare il vetrino nella camera di registrazione. Il blocco della trasmissione inibitoria da picrotossina può provocare attività epilettiforme, cioè spontaneo, cottura sincrona di popolazioni neuronali, che distorcono la misurazione degli eventi evocati. Così, per impedire attività epilettiforme, effettuare unataglio piatto (solo la superficie) tra le regioni CA1 e CA3 per impedire la propagazione attraverso il collaterali Schaffer (come indicato in Figura 2a).
  2. Stratum radiatum astrociti possono essere identificati dalla loro dimensione soma piccolo (circa 10 micron) e processo di assemblaggio stellate. Scegli una cella almeno 20-30 micron sotto la superficie fetta. Montare un elettrodo di stimolazione di vetro (resistenza tip ~ 1 MW) sul filo d'argento che è collegato alla scatola isolamento stimolo e messa a terra per il bagno (semplicemente avvolgendo il secondo filo argento intorno pipetta di vetro). Posizionare l'elettrodo di stimolazione nella regione collaterale Schaffer, come indicato in Figura 2A a una distanza di 200-300 micron di distanza dal astrociti scelto. Montare l'elettrodo di registrazione di campo (~ 2-5 MW) su un filo di argento clorurato collegato al headstage dell'amplificatore. Entrambi gli elettrodi sono riempiti prima con ACSF. Scegliere in modo Multiclamp I = 0, che disabilita com esternocomando di input e posizionare l'elettrodo ~ 50 pm dal astrociti nella regione stratum radiatum (Figura 2A). Registrare le risposte con Gain 2 a 10 e filtro con un filtro di Bessel 2 kHz. Iniezione di corrente elettrica nel cervello innesca fetta potenziali d'azione nei dintorni assoni collaterali Schaffer e il rilascio del trasmettitore successivo ai terminali presinaptici che postsinaptici progetto di neuroni piramidali CA1. I trasmettitori rilasciati attiverà un flusso di carica positiva nelle cellule attraverso i recettori post-sinaptici ionotropici, che è misurabile extracellulare come un potenziale piccolo negativo. Questo campo potenziale postsinaptico eccitatorio (fEPSP) integra l'attività di un gruppo di neuroni attivi contemporaneamente, mentre la trasmissione inibitorio è bloccato farmacologicamente. Applicare alcuni impulsi di test (0.1 msec durata) per evocare un fEPSP, alcuni riposizionamento degli elettrodi di stimolazione potrebbe aiutare ad aumentare la fEPSP. Un tipico CA1 strato Radiatum fEPSP è illustrato nella figura 2B. Ulteriori dettagli sul posizionamento e la risposta forme d'onda possono essere trovati in Yuan et al. 2003 2. L'ampiezza fEPSP in una fetta sana dell'ippocampo di solito dovrebbe essere più di due volte più grande come l'ampiezza del volley fibra. Per la quantificazione accurata di ampiezza fEPSP o pendenza, il reponse evocato deve essere monosinaptico, come attività polisinaptici (rilevabile come un multi-picco di risposta) indica l'attività sinaptica indipendente dalla stimolazione elettrica, che potrebbe essere un segno per ipereccitabilità. Per gli esperimenti effettuati nella regione CA3 dell'ippocampo, stimolazione e pipette di registrazione sono posizionati come illustrato in Figura 3C. Per identificare in modo chiaro gli ingressi in fibra di muschio, che sono fortemente accoppiati, facilitando impulsi di stimolazione (50 msec dell'impulso intervallo) e 1 Hz stimolazione per alcuni secondi vengono applicati per migliorare in maniera massiccia l'ampiezza inizialmente basso evocato fEPSP responses.At finedell'esperimento, DCGIV, un recettore mGluR2 / 3 antagonista, può essere lavato per verificare ulteriormente che gli ingressi fibre muschiose effettivamente stati stimolati. L'applicazione di questo antagonista dovrebbe ridurre il fEPSP da ~ 90% a causa della alta espressione di mGluR2 / 3 recettori inibendo rilascio presinaptico da boutons fibre muschiose.
  3. Riempire una pipetta patch (~ 2-5 MW) con filtrato soluzione interna e montarlo su un filo di argento clorurato collegato al secondo headstage, applicare una pressione positiva con una siringa, che è collegato mediante un tubo al portapipette. Costantemente applicare un impulso di prova 20 msec di 10 mV e spostare la pipetta nel tessuto fino a raggiungere la superficie cellulare e le deformazioni della membrana diventa visibile. Azzerare la pipetta offset, togliere la pressione positiva, e bloccare la membrana - mV 80. Attendere fino a quando un gigaseal (almeno 1 GΩ) viene raggiunto (non dovrebbe richiedere più di alcuni secondi). Applicazione delicata di qualche pressione negativa potrebbe aiutare a raggiungere agigaseal. Penetrare nella cellula viene raggiunto da una breve applicazione di pressione negativa o utilizzando la funzione zap in Multiclamp. Avviare la registrazione simultanea delle garanzie Schaffer evocato fEPSP e la risposta astrogliale in voltage-clamp (Vhold - 80 mV; frequenza di 0,1 Hz guadagno, filtro di Bessel 2 kHz, 10). La risposta astrogliale attuale è bifasica: in primo luogo si vedrà una veloce corrente transitoria verso l'esterno, che riflette fEPSPs generati dalle adiacenti cellule piramidali. Questo è seguito da un lento aumento e decadente verso l'interno (secondi alcuni persistenti (> 10 sec) dopo il termine delle risposte neuronali) attuali. Questa corrente è dovuto principalmente all'entrata potassio in astrociti, seguito dal rilascio circostante depolarizzate terminali postsinaptici. Un attivati ​​contemporaneamente veloce trasportatore del glutammato transitorio di corrente (GLT), innescato da rilascio di glutammato presinaptico è mascherato dalla corrente di potassio. Il potenziale di mantenimento della astrociti, così come la resistenza accesso del cerotto deve essere monitored tutto l'esperimento e non deve variare di oltre il ~ 20%, al fine di evitare il controllo impreciso di reponses astrogliali a causa di variazioni delle condizioni di registrazione. Astrociti Solo con una potenzialità iniziale di partecipazione> -70 mV devono essere indagati per studiare le cellule sane.
  4. Passare dalla tensione e corrente-clamp, al fine di registrare la depolarizzazione della membrana evocato astrociti. Isolare il trasportatore del glutammato gliale (GLT) corrente perfusione dell'acido ionotropici bloccante del recettore glutammato chinurenico (5 mM), finché il fEPSP è completamente bloccato e l'ampiezza GLT ha raggiunto un plateau. Per identificare con chiarezza l'attuale GLT, applicare l'antagonista specifico DL-treo-β-Benzyloxyaspartatic acido (DL-TBOA, 200 pM). Aumentare la forza stimolazione da due volte a 5 volte per registrare le risposte neuronali e astrogliale a diversa forza sinaptica, e applicare due stimoli ravvicinati intervallo (50 msec) per indagare le risposte alla stimolazione impulsi accoppiati. Stabilità della serie rpotenziale esistance e la membrana della cellula gliale devono essere monitorate per la registrazione.
  5. Per visualizzare l'entità del gap-junction mediata reti astrogliali, colorante esperimenti di accoppiamento deve essere eseguito in modalità current clamp, senza alcuna corrente di iniezione, per consentire la diffusione passiva di coloranti molecolari bassi (<1,5 kDa), come solforodamina-B, attraverso i canali di giunzione gap. Per minimizzare spillover colorante nel tessuto circostante, pressione positiva deve essere applicato tramite pipetta patch basta quando entrano nel tessuto e la patch dovrebbe essere raggiunto il più presto possibile.

Risultati

Un rappresentante registrazione simultanea di synaptically-risposte evocate astrogliali e neuronali (fEPSPs) nell'area CA1 dell'ippocampo è mostrato in Figura 2 AB. La corrente evocata astrogliale è bifasica, cioè costituito da una corrente transitoria verso l'esterno e una corrente lenta decomposizione attivo (> 10 sec) (Figura 2B). La corrente verso l'esterno riflette la fEPSP evocato, ed è bloccato dopo l'inibizione dei recettori del glutammato ionotropici da acido chinurenico (grigio scuro traccia, figura 2B) 3. La maggior parte della corrente lenta verso l'interno riflette entrata potassio nel seguente astrociti depolarizzazione postsinaptica, essendo anche abolito da acido chinurenico, che inibisce l'attività postsinaptica glutammato ionotropici recettore (Figura 2B e 2C Figura 1) 3-6, noto per rappresentare la principale di origine (80%) del rilascio di potassio 7. Il restante un rapido aumentod corrente di decadimento verso l'interno è inibito dal antagonista GLT DL-TBOA (grigio chiaro traccia, figura 2B 2C e Figura 2). Post-hoc sottrazione della corrente residua lento in TBOA (grigio chiaro traccia) dalla corrente in acido chinurenico (grigio scuro traccia) permette l'isolamento del trasportatore puro glutammato astrogliale corrente (traccia nera), come illustrato in Figura 2C 2. Il persistente lentamente decadere corrente in acido chinurenico e TBOA (grigio chiaro traccia, Figura 2B e 2C Figura 2) può essere bloccata da TTX (dati non mostrati), e riflette più probabile l'accumulo di K + extracellulare rilasciato durante la cottura presinaptica afferente 3. Moderata stimolazione singola collaterali di Schaffer induce una corrente relativamente grande synaptically-evocata astrogliale rispetto alla depolarizzazione piccola evocata registrata nella stessa cella (Figura 2D). Ciò è dovuto almembrana bassa resistenza di astrociti. Registrazione della dinamica membrana synaptically-astrogliali potenziali evocati, come illustrato nella Figura 2D, è una misura diretta di locali livelli extracellulari di potassio 8. Normalizzazione delle risposte evocate astrogliali all'attività neuronale sottostante permette il confronto diretto di diversi esperimenti, come recentemente dimostrato 6. Correnti astrogliali può inoltre monitorare molto affidabile alterazioni trasmissione eccitatoria, come la corrente totale synaptically-evocata astrogliale segue linearmente l'aumento del fEPSP (Figura 2E). Correnti astrogliali riflettono anche a breve termine plasticità sinaptica, dal momento che mostrano, come i neuroni, abbinato impulsi facilitazione (Figura 2F). Accoppiato a cellula intera registrazione di una cella CA1 piramidale ed un astrocita rivelano molto diverso comportamento elettrofisiologico in entrambi i tipi cellulari, poiché i potenziali di azione di visualizzazione neuronali in risposta ad un impulso depolarizzante,mentre il astrocyte vicina è silenzioso (Figura 3A-B). Tuttavia, la stimolazione moderata delle collaterali Schaffer può evocare simultaneamente una rapida potenziale eccitatorio posynaptic nella cella CA1 piramidale e un veloce e lento correnti esteriori attivo in astrociti adiacente (3B Figura 2). Registrazioni duali di synaptically-evocate risposte neuronali e astrogliale possono anche essere registrati nell'area CA3 dell'ippocampo, come mostrato in Figura 3C. Infatti, la stimolazione singola di CA3 fibre muschiose evoca in condizioni basali risposte neuronali molto piccoli, registrati come fEPSPs locali, associati a piccoli veloci correnti di andata e lento verso l'interno negli astrociti (Figura 3D 1). In contrasto, 1 Hz stimolazione di CA3 fibre muschiose per alcuni secondi potenzia fortemente la fEPSP, mentre solo moderatamente aumenta la risposta astrogliale (Figura 3D 2).

figure-results-1
Figura 1. Isolamento Hippocampus per preparare sezioni trasversali. A sezionare il cervello, tagliare il cranio lungo la linea mediana (a). Eseguire un taglio coronale a livello del bulbo olfattivo (b) e successivamente a livello del cervelletto (c). Rimuovere con cura il cranio con l'aiuto di una pinza (d), separare i due emisferi con una lama (e), e trasferirli su un cucchiaino in freddo ACSF ossigenato (f). Dopo ~ 5 min equilibrazione, collocare un emisfero su tessuto asciutto con la superficie mediale up (g). Con l'aiuto di due cucchiai rimuovere il diencefalo (hj). L'ippocampo è ora visibile, come illustrato dalle linee tratteggiate (k). Sezionare l'ippocampo con un cucchiaio, partendo dalla fimbria, visibile come struttura bianca (lm). Trasferire l'ippocampo di nuovo nel ACSF freddo. Preparare una piccola agarosio-blocco, la posizione di due ippocampi con il lato alveus e l'ippocampo ventraleci rivolto verso il bordo del blocco di agar, e immergere accuratamente tutto il liquido di distanza per permettere un buon attacco alla agar (n). Colla l'ippocampo attaccato al blocco agar sulla parte ventrale (o).

figure-results-2
Figura 2. Simultanee risposte neuronali e astrogliale evocati-sinapticamente nell'area CA1 dell'ippocampo. A) Schema della fetta ippocampale illustra la disposizione dell'elettrodo stimolante, per attivare il collaterali Schaffer (SC), l'elettrodo pipette patch, per registrare correnti astrocitari, e l'elettrodo extracellulare, per registrare fEPSP, evocata dalla stimolazione SC nel hippocampal CA1 area. B) le tracce rappresentativi di registrazioni simultanee di fEPSPs (pannello superiore) e le correnti astrocitari (pannello inferiore) evocati-sinapticamente di stimolazione SC nel presence di droghe farmacologiche. Le risposte sono registrate prima in presenza di un antagonista del recettore GABA A (picrotossina, 100 pM, tracce nere) per isolare risposte eccitatorie. Successiva applicazione di un bloccante dei recettori ionotropici del glutammato (acido chinurenico, 5 mM, tracce grigio scuro), inibisce la fEPSP e la maggior parte della corrente di lunga durata astrogliale, smascherando una piccola componente e veloce transitoria della risposta astrocitica corrente, che è sensibili a un bloccante trasportatore del glutammato (TBOA, 200 pM, tracce grigio chiaro). Barra Scala, fEPSP 0,1 mV, astrociti attuali 15 pA, 10 msec. C 1). Traccia campione del potassio astrogliale corrente (1-2), che può essere isolato dalla risposta evocata, mostrato in B (pannello inferiore, nero traccia), sottraendo la componente di corrente residua in acido chinurenico (2) dalla corrente totale ( 1). Barra Scala, 20 pA, 1 sec. C 2) traccia Campione del trasportatore del glutammato corrente (2-3), ottenuto sottraendo il i TBOAnsensitive componente lenta (3) dalla corrente in acido chinurenico (2). Barra della scala, 2.5 pA, 25 msec. D) Esempi tracce di una corrente interna registrata in voltage-clamp (pannello inferiore) e la depolarizzazione della membrana corrispondente registrata in current-clamp (pannello superiore) indotto in un astrociti dalla stimolazione SC. Barra Scala, current-clamp 1,5 mV, voltage-clamp 5 pA, 1 sec. E) di ingresso-uscita curve che illustrano il rapporto tra la fibra raffiche presinaptico (input) e la corrente totale astrogliale (uscita) registrata contemporaneamente in risposta alla stimolazione SC (n = 6). Gli aumenti astrogliali corrente linearmente con le raffiche di fibre maggiori, come il fEPSP neuronale. F) tracce di esempio della risposta neuronale (fEPSP) e la corrente astrociti sono mostrate per paired-impulso di stimolazione ad un intervallo di 40 msec dell'impulso. I sinapticamente-evocati mostre astrogliali attuali, come i neuroni, paired-pulse facilitazione. Barra della scala, 0.1 mV, 5 pA, 20 msec.

figure-results-3
Figura 3. Registrazioni doppie di risposte neuronali e astrogliale sinapticamente indotti nelle aree CA1 e CA3 dell'ippocampo. A) Ricostruzione di una cellula piramidale CA1-iniettato con sulforodamina B (rosso, 0,1%) e un astrocita riempito con fluoresceina destrano (verde, 0,1%), utilizzando il whole-cell patch-clamp. Scala bar, 10 micron. B 1) rappresentativi di tracce simultanee di cellule intere registrazioni di potenziali di membrana registrati in current-clamp da una cella CA1 piramidale e un astrociti adiacente. Neuronale cottura potenziale d'azione (nero traccia), evocato da iniezione di un PA 20 depolarizzante impulso di corrente, evoca alcuna risposta in astrociti adiacente (grigio traccia). Barra Scala, 20 mV, 10 pA, 100 msec. B 2) Esempi di tracce di due cellule intere registrazioni di una cellula piramidale CA1 in corrente-vongolap ed un astrociti vicina in voltage-clamp dopo stimolazione SC in presenza di picrotossina (100 pM). SC stimolazione evoca un potenziale postsinaptico eccitatorio (EPSP, nero traccia), associato ad una piccola corrente e duraturo astrocitica (grigio traccia). Bar Scala, 5 mV, 10 pA, 100 msec. C) Schema della fetta ippocampale raffigurante nel giro dentato (DG) e CA3 aree la disposizione degli elettrodo stimolante, per attivare le fibre muschiose, l'elettrodo pipette patch (grigio), per registrare correnti astrocitari, e l'elettrodo extracellulare, a Record fEPSP, evocata dalla stimolazione CA3 muschio fibre. D, E) tracce rappresentativi di registrazioni appaiati del CA3 fEPSPs (pannelli superiori, tracce nere in D 1 e D 2) e astrocitari cellule intere risposte (pannelli inferiori, tracce grigie D 1 e D 2) alla stimolazione singola CA3 muschio fibre a 0,02 Hz (zoom nel riquadro) (D 1) o ad 1 Hz di frequenza di stimolazione (D 2). Bar Scala per D 1 e D 2, 0,2 mV, 15 pA, tempo: 1 sec D 1, D 2 100 msec. Scala grafica Inset, 0.1 mV, 100 msec.

Discussione

Registrazione doppio di sinapticamente-indotte risposte neuronali e gliali è un metodo utile per studiare le alterazioni online in attività pre-e post-sinaptica associati a cambiamenti nelle proprietà astrogliali. La depolarizzazione della membrana sinapticamente-evocata gliale è una misura diretta della crescita extracellulare di potassio 8, in parte a causa di cottura presinaptico potenziale d'azione, ma soprattutto per depolarizzazione postsinaptica 7. Pertanto le registrazioni della dinamica gliali potenziale di membrana può essere utilizzata per studiare le modifiche in eccitabilità presinaptico, attività post-sinaptica, il volume dello spazio extracellulare e capacità buffer di potassio 6, 8. Il astrogliale attuale trasportatore del glutammato è una misura sensibile di rilascio di glutammato presinaptico, in grado di monitorare cambiamenti a breve termine di probabilità di rilascio 3, 5, 9. Può inoltre essere utilizzato per caratterizzare le sinapsi funzionali-glia interazioni a livello delle sinapsi diversi o in differenti st sviluppoetà 10. Va sottolineato che GltS sono altamente sensibili alla temperatura 11 e sono azionati dal gradiente elettrochimico del Na +, K + e H 12. Così l'ampiezza e la cinetica della corrente GLT fortemente dipendente dalle condizioni sperimentali adottate. Inoltre, la durata effettiva di liquidazione glutammato astrogliale derivata dalla corrente GLT registrata è noto per essere parzialmente oscurato. Ciò è dovuto al filtraggio delle correnti GLT da fattori come le proprietà elettrotoniche astrociti o lo svincolo trasmettitore asincrono che alterano la cinetica 13. Metodi di estrazione delle caratteristiche temporali dei meccanismi di filtraggio sono state sviluppate e possono essere utilizzati per ricavare la distanza effettiva corso glutammato tempo in condizioni fisiologiche o patologiche, come recenly eseguita 6,13,14. Inoltre, la registrazione simultanea della depolarizzazione della membrana astrogliale, nel morsetto corrente, può fornire INSIGhts in possibili alterazioni del potassio extracellulare transitori. Astrociti singolo contatto fino a 100.000 sinapsi di circa 100 neuroni diversi, e sono perciò integrare e modulare l'attività di reti neuronali locali.

Quando si utilizza la tecnica qui presentati, vale a dire la registrazione elettrofisiologiche di cellule intere interventi di astrociti di acquisire conoscenze in attività sinaptica basale, si dovrebbe tenere a mente che in astrociti, patch-clamp a livello soma consentire correnti di rilevamento per lo più provenienti dal soma cellulare o processi prossimali. Infatti, le correnti rilevati al soma solo in parte provengono da sottili processi distali quando una forte attivazione dei recettori e dei canali si verificano in più processi sottili in grado di generare correnti che si propagano al soma cella. Così recettore basale e l'attività dei canali in singoli piccoli processi astrogliali coprono compartimenti sinaptici è difficilmente rilevabile. Ciò è dovuto in parte alla limitata battibeccocontrollo IAL e temporale delle correnti di membrana e delle tensioni di cellule intere patch-clamp da astrociti in situ. Tuttavia, va notato che la superficie delle abbondanti processi minuscoli astrocitari supera di gran lunga l'area della membrana dei processi soma e principale. Inoltre, questi microdomini perisynaptic astrogliali contengono i recettori funzionalmente rilevanti e canali, che probabilmente svolgono un ruolo importante nella comunicazione neuroglia e regolazione sinaptica. La tecnica che abbiamo presentato qui è quindi particolarmente utile per studiare l'integrazione di attività sincrona astrociti da insiemi neuronali, che si verifica in particolare durante la stimolazione afferenza. Essa non deve essere usato per studiare il dialogo tra singole sinapsi ei processi adiacenti pregiati astrocitari verificano durante basale attività spontanea. Un metodo alternativo per studiare locali astrogliali risposte indotte da basale sinaptica sarebbe effettuare patch-clamp da processi sottili, come duno in dendriti 15. Anche se l'applicazione di patch questi processi belle astrogliali è probabilmente difficile a causa delle loro piccole dimensioni, è probabilmente la strada da seguire per svelare dialogo più intimo tra microdomini astrogliali e sinapsi individuali. Tuttavia, le probabili piccole risposte elettrofisiologiche astrogliali derivanti dai singoli processi sottili astrogliali può essere al di sotto della soglia di rilevazione, dal momento che il rumore elettrico raggiunge in media 3-5 pA in patch-clamp. Un altro metodo per studiare le risposte astrogliali l'attività sinaptica è l'imaging di calcio, dal momento che l'attivazione dei recettori di membrana astrocitari o trasportatori di sostanze neuroattivi può innescare transienti di calcio intracellulare. Tuttavia, caricamento di massa degli astrociti con indicatori di calcio può anche riflettono principalmente l'attività somatica 16. La combinazione di imaging elettrofisiologia e di calcio permette anche di rilevare segnali di calcio di piccole dimensioni da sottili processi astrogliali, possono essere di origine spontanea o innescata by minima stimolazione sinaptica 17, 18. Tuttavia, si dovrebbe tenere a mente che ad alta affinità indicatori di calcio potrebbe agire come buffer di calcio, inibendo le vie di segnalazione di calcio importanti, mentre a bassa affinità indicatori potrebbe funzionare sotto il livello di rilevamento. Infine, una tecnica elegante e non invasivo per studiare gli eventi di calcio in sottili processi astrocitari, che aggira anche il dilavamento di molecole di segnalazione intracellulare durante whole-cell patch-clamp, consiste nell'utilizzare un sensore mirato calcio membrana, che può essere espresso in astrociti in situ, come pure in vivo 19. Tuttavia, l'imaging di calcio può fornire solo informazioni su una molecola di segnalazione, che è coinvolto in molte, ma non tutte le attività cellulari, mentre whole-cell patch-clamp fornisce informazioni quantitative su tutte le diverse correnti ioniche attivate su canale e l'attivazione del recettore. Registrazioni elettrofisiologiche Pertanto simultanei da neuroni e astrocitisono un metodo unico e potente per svelare on-line le dinamiche di neuroglia segnalazione ionica e il suo cervello l'elaborazione ruolo dell'informazione.

Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Dana Kamalidenova, Morgan Autexier, e Rocco Chopier, che ha fatto il video e animazioni, così come Florian Beck per le fotografie e la post-produzione del video voice-over. Questo lavoro è stato sponsorizzato da Olympus e sostenuto dalle concessioni dal HFSPO (Sviluppo Premio alla Carriera), ANR (Jeunes Chercheurs programma e il programma Blanc Neuroscienze), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), INSERM e La Pitié Salpêtrière (ricerca traslazionale contratto) a NR, dal francese di ricerca Ministero e Deutsche Forschungsgemeinschaft borse postdoc a UP, e dalle scuole di dottorato "Frontiere della scienza della vita", Università Paris Diderot, Bettencourt Schuller fondazione, e FRM (Fondation pour la Recherche Médicale) dottorato di JS

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti (opzionale)
Picrotoxin Sigma P1675 sciogliere in DMSO
Acid Kynurenic Tocris 0223 sciogliere a 34 ° C agitazione o sonicazione
DL-TBOA Tocris 1223 DCG IV Tocris 0975

Riferimenti

  1. Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. N., et al. , (2001).
  2. Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
  3. Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
  4. Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
  5. Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
  6. Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
  7. Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
  8. Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
  9. Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
  10. Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
  11. Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
  12. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  13. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
  14. Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
  15. Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature. 1, 1235-1247 (2006).
  16. Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
  17. Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  18. Castro, M. A. D. i, et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
  19. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Risposte neuronali astroglialicorrenti evocate sinapticamentetecnica patch clampregistrazione dei potenziali di campoastrociti dello stratum radiatumanalisi dell uptake del glutammatovalutazione del buffering del potassiomisurazione del rilascio di gliotrasmettitori

Articoli correlati