Peptide: MHC Tetramero basata Arricchimento di epitopi specifici per cellule T

Sommario

Questo protocollo descrive l'uso del peptide: MHC tetrameri e microsfere magnetiche per isolare popolazioni bassa frequenza di epitopo-specifiche cellule T e analizzarli mediante citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio diretto delle popolazioni di cellule T endogene di interesse da In vivo Sistemi sperimentali.

Abstract

Una necessità di base per i ricercatori che studiano immunità adattativa con modelli sperimentali in vivo è la capacità di identificare cellule T in base al loro recettore antigene sulla cellula T (TCR) specificità. Molti metodi indiretti sono disponibili in cui una popolazione di cellule T bulk è stimolata in vitro con un antigene specifico epitopo-specifici e le cellule T sono identificati mediante la misurazione di una risposta funzionale come proliferazione, produzione di citochine, o l'espressione di marcatori di attivazione ^1. Tuttavia, questi metodi solo identificare epitopi specifici per cellule T presentano una delle tante possibili funzioni, e non sono sufficientemente sensibili per rilevare le cellule T epitopo-specifici a frequenze precursori naive. Un'alternativa popolare è il modello transgenico trasferimento TCR adottiva, in cui le cellule T monoclonali da un topo transgenico TCR sono seminati in istocompatibili host per creare una vasta popolazione precursore di epitopo-specifiche cellule T che possono essere facilly cingolato con l'uso di un anticorpo marcatore congenic ^2,3. Mentre potente, questo metodo soffre di artefatti sperimentali associate alla frequenza fisiologica di cellule T con specificità per un singolo epitopo ^4,5. Inoltre, questo sistema non può essere usato per studiare l'eterogeneità funzionale di epitopo-specifici cloni di cellule T all'interno di una popolazione policlonale.

Il modo ideale per studiare l'immunità adattativa dovrebbe coinvolgere il rilevamento diretto di cellule T epitopo-specifici del repertorio endogeno delle cellule T utilizzando un metodo che distingue la specificità TCR esclusivamente dal suo legame con l'affine peptide: MHC (pMHC) complessi. L'utilizzo di tetrameri pMHC e citometria di flusso realizza questo ^6, ma è limitata alla rilevazione di popolazioni ad alta frequenza di epitopo-specifiche cellule T solo trovati seguente indotta da antigene espansione clonale. In questo protocollo, si descrive un metodo che coordina l'uso di tetrameri pMHC e magnetecnologia delle celle tic arricchimento abilitare il rilevamento di frequenza estremamente bassa epitopo-specifiche cellule T di topo tessuti linfoidi ^3,7. Con questa tecnica, si può globalmente intera traccia epitopo-specifiche popolazioni di cellule T endogene in topi in tutte le fasi della risposta immunitaria.

Protocollo

1. Isolamento delle cellule da tessuto linfoide

1. Aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen / strep, gentamicina, 2 mM L-glutammina, 55 mM 2-mercaptoetanolo) o altro equivalente mezzo di cellule T, un piatto di coltura di 60 millimetri contenente un piccolo quadrato di nylon 100 micron maglia e posto sul ghiaccio.
2. Eutanasia mouse.
3. Rimuovere la milza e come molti nodi linfatici facilmente accessibili possibile. Queste dovrebbero includere almeno le inguinali, ascellari, brachiale, linfonodi cervicali, e mesenterici. Metterli sulla parte superiore della maglia di nylon in piatto di coltura.
4. Utilizzando la cima ....

Risultati

La figura 1 illustra rappresentante trame citometria a flusso di milza pMHCII tetramero arricchito e campioni di linfonodi di topi naive, mentre la figura 2 mostra i dati rappresentativi per topi precedentemente immunizzati con il peptide corrispondente + CFA. Gating seriale rimuove eventi indesiderati autofluorescenti e altre dall'analisi di CD4 + popolazioni di cellule T. Il CD8 + popolazione di cellule T serve come controllo interno negativo utile per la colorazione pMHCII tetram.......

Discussione

Il pMHC tetramero metodo basato arricchimento delle cellule presentata da questo protocollo è un potente strumento per lo studio delle cellule T epitopo-specifici di cellule T endogene repertori. L'utilizzo di tetrameri pMHC consente il rilevamento di epitopo-specifiche cellule T basati direttamente sulla capacità dei loro TCR per legare ligandi affini pMHC. L'arricchimento fornisce un livello di sensibilità in modo tale che le popolazioni estremamente rari di antigene-specifiche cellule T può essere rilevata da.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagente Fornitore Numero di catalogo
PE o APC coniugato pMHC tetramero (o multimero)	Realizzato da investigatore, ottenuto dal nucleo NIH tetramero, o acquistati da fonti commerciali
Anti-PE microsfere coniugate magnetici	Miltenyi	130-048-801
Anti-APC microsfere coniugate magnetici	Miltenyi	130-090-855
Colonne LS magnetici	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS o QuadroMACS magnete	Miltenyi	130-042-302 o 130-090-976
Cell conteggio perline	Life Technologies	PCB-100