Isolamento di fibroblasti normali e tumorali associata da tessuti freschi di fluorescenza activated cell sorting (FACS)

Yoray Sharon; Lina Alon; Sarah Glanz; Charlotte Servais; Neta Erez

doi:10.3791/4425

Articolo metodologico

Isolamento di fibroblasti normali e tumorali associata da tessuti freschi di fluorescenza activated cell sorting (FACS)

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DOI:

10.3791/4425

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14 gennaio 2013

Yoray Sharon¹ , Lina Alon¹ , Sarah Glanz¹ , Charlotte Servais¹ , Neta Erez¹

¹Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel Aviv University

In questo articolo

Sommario

Cancro fibroblasti associati (CAF) facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione, l'angiogenesi, e l'infiammazione. Qui si descrive un metodo per isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF dal topo freschi e tessuti umani mediante selezione delle cellule, utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie.

Abstract

Cancro-associate fibroblasti (CAF) sono il tipo cellulare più prominente nello stroma del tumore di molti tumori, in particolare carcinoma mammario, e la loro presenza prominente è spesso associato con ^1,2 prognosi. CAF sono una sottopopolazione di fibroblasti attivati stromali, molti dei quali esprimono il marcatore myofibroblast α-SMA ^3. CAF provengono da fibroblasti tissutali locali nonché da midollo osseo, cellule reclutati nel tumore sviluppare e adottare un fenotipo CAF sotto l'influenza del microambiente tumorale ^4. CAF sono stati dimostrato di facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione delle cellule tumorali, l'angiogenesi e l'invasione ^5-8. Abbiamo dimostrato che i CAF migliorare la crescita tumorale di mediazione che promuove l'infiammazione del tumore, a partire al più presto pre-neoplastiche stadi ^9. Nonostante la crescente evidenza dei CAF ruolo chiave svolgere nel facilitare la crescita tumorale,CAF studiano è una continua sfida a causa della mancanza di CAF-specifici marcatori e l'eterogeneità parte di queste cellule, con molti sottotipi coesistenti nel microambiente tumorale ^10. Inoltre, studiando fibroblasti in vitro è ostacolato dal fatto che il loro profilo di espressione genica è spesso alterato in coltura tissutale ^11,12. Per risolvere questo problema e per consentire imparziale profilo di espressione genica di fibroblasti di topo fresco e tessuti umani, abbiamo sviluppato un metodo basato sui protocolli precedenti per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) ^13,14. Il nostro approccio si basa su utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie per isolare i fibroblasti di topo freschi e tessuti umani. PDGFRα è abbondantemente espresso da entrambi i fibroblasti normali e CAF ^9,15. Questo metodo permette di isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF, tra cui, ma non limitato a α-SMA + attivato miofibroblasti. Fibroblasti isolati possono quindi essereutilizzati per la caratterizzazione e confronto dell'evoluzione di espressione genica che si verifica nei CAFS durante la tumorigenesi. In effetti, noi e gli altri segnalati profilo di espressione di fibroblasti isolati da cellule ordinamento ^16. Questo protocollo è stato eseguito con successo per isolare e creare un profilo popolazioni altamente arricchito di fibroblasti dai tessuti della pelle, della mammella, del pancreas e del polmone. Inoltre, il nostro metodo permette anche di coltura delle cellule filtrate, per eseguire esperimenti funzionali e per evitare contaminazione da cellule tumorali, che spesso è un grosso ostacolo quando si cerca di CAF cultura.

Protocollo

1. Dissezione tessuto mammario o con la pelle di topi

Prima di sezionare il tessuto desiderato dai topi, preparare le seguenti forniture e dei reagenti:
Materiali di consumo:
- Strumenti chirurgici (lavato con detergente e poi immersi in 70% etanolo).
- Superficie di polistirolo per appoggiare il mouse su durante la dissezione.
- Pins o aghi per tenere i topi durante la dissezione.
- Vaso di vetro con coperchio per la digestione, contenente barra di agitazione magnetica (autoclave).
- Bagnomaria a 37 ° C, contenente un agitatore magnetico sommergibile e acqua sufficiente per immergere il vaso digestione, mentre appoggio alla piastra di agitazione.
Reagenti:
- FACS buffer di I: (4 ° C): fosfato Dulbecco Buffered Saline CMF (Calcio Magnesio gratuita) + 0,5% di BSA
- Soluzione di collagenasi (immediatamente prima dell'uso):
  0,05 g Collagenasi II
  0,05 g Collagenasi IV
  0,01 g Deoxyribonuclease
  20ml FACS tampone I. Tenere soluzione di collagenasi in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- PharmLyse (cloruro di ammonio Reagente di lisi).
- FACS tampone II: fosfato Dulbecco Buffered Saline CMF + 1% FCS.
Dissezione delle ghiandole mammarie (vedi anche ^17).
- Eutanasia topi di sesso femminile con anidride carbonica (CO ₂₎ inalazione.
- Su una superficie di polistirolo, posizionare il mouse sul dorso e pin saldamente tutti e quattro gli arti con aghi calibro 25 (Figura 1A). Spruzzare il mouse generosamente con il 70% di etanolo.
- Utilizzando pinze, tirare la pelle addominale sulla linea mediana e fare una piccola incisione con le forbici affilate.
- Partendo dall'incisione, tagliare la pelle fino al collo dell'animale evitando pungere cavità addominale o toracica.
- Tagliare la pelle delle gambe posteriori della incisione mediana verso la gamba, risultanti in una "forma Y".
- Tirare la pelle lontano dal corpo del mouse e definire, esponendole ghiandole mammarie fissato al lato inferiore della pelle (Figura 1B).
- Utilizzare Q-tips per separare delicatamente ghiandole mammarie dalla pelle durante il taglio di tessuto connettivo, con piccole forbici affilate per separare la ghiandola mammaria verso la colonna vertebrale del mouse.
- Le ghiandole addominali (# 4, 5) sono i migliori per questo protocollo. È inoltre possibile utilizzare la ghiandola mammaria 2 ^°, ma tenere a mente che queste ghiandole sono anatomicamente trova in prossimità del muscolo pettorale, che può essere difficile da separare, con conseguente cellule di origine del tessuto misto.
- Nota: Quando la dissezione del tessuto tumorale, si consiglia di rimuovere le aree necrotiche.
La dissezione del tessuto cutaneo: Il modo più semplice per ottenere tessuto cutaneo, senza avere a che fare con la rimozione dei capelli è quello di utilizzare le orecchie del mouse. Se una maggiore quantità di tessuto è necessario, è possibile radersi i capelli dal tronco del mouse e sezionare la pelle.
- Eutanasia topo, utilizzando CO ₂ inalazione.
- Utilizzando forbici affilate, tagliare entrambe le orecchie e mettere subito in vaso di digestione contenente un piccolo volume (~ 0,5 ml) di PBS su ghiaccio.

2. Preparazione della ghiandola mammaria / pelle Sospensione singola cella

Posizionare ghiandole mammarie / pelle in vaso di digestione contenente un piccolo volume di PBS sul ghiaccio. Se il tessuto è sanguinosa x2 lavaggio con PBS, e quindi eliminare l'eccesso di PBS.
Tritare accuratamente con le forbici curve.
Aggiungi (nota: questa quantità di soluzione di collagenasi in modo efficiente dissociare circa 5 g di tessuto mammario o tumore e le orecchie da fino a 15 topi) 20 ml di soluzione di collagenasi.
Mettere immediatamente mescolare piastra a 37 ° C in bagno d'acqua, e incubare per 15 minuti sotto agitazione al tasso medio.

Nota: i tempi ottimali di incubazione può variare se digerire altri tessuti.

Per arrestare la reazione, aggiungere 30 ml DMEM freddo + 10% FCS.
Filtrare il tessuto / media throug miscela70 ha filtro cella um collocato su un tubo da 50 ml.
Centrifugare la provetta conica per 5 min a 450 xg a 4 ° C.

3. Blood Red Cells Lysis

Nota: questo passaggio non è necessario se i topi sono stati il cuore perfusi con PBS prima di essere sacrificati.

Aspirare il supernatante usando una pipetta di vetro collegato a vuoto, senza disturbare il pellet.
Per lisare RBC, risospendere il pellet cellulare in 10 ml di soluzione di PharmLyse e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
Neutralizzare la soluzione PharmLyse con l'aggiunta di circa 40 ml di FACS tampone I.
Centrifugare la provetta conica con le cellule per 5 min a 450 xg a 4 ° C.
Aspirare il surnatante.

4. Blocco di Fc endogena

Opzionale: cellule Count per determinare il volume appropriato per le fasi successive.
Risospendere le cellule in 1-3 ml di FACS buffer di I (a seconda on numero di cellule, e la quantità di anticorpi che si desidera utilizzare).
Aggiungi FcBlock (anti-mouse CD16/CD32) per raggiungere diluizione 1:50 (10 pg / ml), e incubare su ghiaccio per 10-20 '.
Non c'è bisogno di lavare FcBlock.

5. Colorazione

Estrarre aliquote di 100 pl per provette Eppendorf da utilizzare come un non-tinto controllo e comandi a singolo colore (a seconda del numero di anticorpi fluorescenti utilizzate).
Per fibroblasti etichetta: aggiungere anti-PDGFRα (direttamente coniugato fluoroforo) ad una diluizione di 1:50 (10 pg / ml).
Per etichettare popolazioni cellulari (es. cellule immunitarie, macrofagi, cellule endoteliali ecc): aggiungere appropriati anticorpi fluorescenti coniugati a marcatori di superficie, ad una diluizione 1:50.

Nota: sebbene PDGFRα è un marcatore robusto per fibroblasti, si raccomanda di includere anticorpi per cellule immunitarie e cellule epiteliali in modo da escludere qualsiasi positivo doppiapopolazioni e quindi aumentare la purezza dei fibroblasti isolati.

Aggiungere 2 microlitri di ciascun anticorpo a ciascuno dei singoli tubi eppendorf colore controllo.
Incubare le cellule con anticorpi per 1 ora su ghiaccio al buio.
Per lavare: riempire i tubi con tampone FACS I e girare per 5 min a 450 xg a 4 ° C.
Aspirare il surnatante, risospendere le cellule in tampone FACS I a una concentrazione di circa 2 x 10 ⁶ cellule / ml, o qualsiasi concentrazione più appropriato per l'ordinamento con il sorter disponibili FACS.

Opzionale: Le cellule possono essere risospese in tampone FACS II per la durata di smistamento. Questo può migliorare la vitalità cellulare. Tuttavia, l'esposizione a fattori nel siero possono avere un effetto espressione genica, che deve essere testato, e prese in considerazione.

Trasferire cellule marcate in tubi FACS con filtro migliori: celle filtranti nei tubi per evitare grumi di cellule.
Per escludere cellule morte, aggiungere 7AAD (0,5 mcg / ml) o Propidium Ioduro (PI) ai campioni (tranne che per il non-macchiato di controllo).

Nota: Per evitare di sprecare le celle, è possibile aggiungere 7AAD/PI al non-tinto campione dopo la registrazione nel FACS, e usare di nuovo come 7AAD-solo il controllo.

Conservare i campioni in ghiaccio durante l'analisi.

6. Isolamento delle cellule da FACS

(Nota: questa parte del protocollo richiede conoscenza nella gestione di un selezionatore FACS, ad esempio BD FACS AriaII, o l'assistenza di un tecnico specializzato).

Utilizzando il software di FACS sorter (BD FACSDiva), preparare grafici di analisi adeguati per l'analisi forward scatter (FSC), dispersione laterale (SSC), 7AAD, FITC, PE e qualsiasi altro fluoroforo utilizzato per etichettare le cellule (Figura 2).
Prima di caricare ogni campione al cell sorter, vortice brevemente per risospendere le cellule.
Inizia analizzando il campione non colorato per impostare il gating della popolazione cellulare totale, per escludere il celL detriti, e per determinare autofluorescenza o colorazione di fondo.
Analizzare campione senza macchia + 7AAD per determinare e porta la popolazione di cellule vive della popolazione cellulare totale.
Analizzare ogni singolo controllo del colore per determinare e calibrare i parametri quali la compensazione.
Analizzare il campione colorato per definire la posizione di porte per l'ordinamento.
Una volta che i parametri e le porte per le popolazioni cellulari desiderati sono stati impostati, iniziare l'ordinamento dei popolazioni di cellule etichettate in provette Eppendorf o provette da 15 ml coniche contenenti terreno di coltura o tampone di lisi RNA (come RLT tampone o Trizol).

Nota: Se l'ordinamento di un gran numero di cellule, non è consigliabile per ordinare direttamente nel tampone di lisi RNA, come il volume di liquido guaina accompagna le cellule diluire il tampone di lisi e ridurre la resa.

Spin celle in basso subito dopo la cernita è finito, e il trasferimento in terreno fresco o tampone di lisi RNA, dein attesa dello scopo dell'esperimento.
Se l'ordinamento, al fine di isolate cellule di coltura, eseguire sorta sterile. Per migliore recupero delle cellule, utilizzare rosso fenolo libero DMEM + 5% FCS anziché FACS tampone II e raccogliere cellule in mezzo di coltura con 20% FCS.
Se la coltura ordinati fibroblasti, alwaysplate su piastre rivestite di collagene e mai direttamente sulla plastica come questo si traduce in attivazione dei fibroblasti che portano a cambiamenti nella loro espressione genica.