Isolamento di fibroblasti normali e tumorali associata da tessuti freschi di fluorescenza activated cell sorting (FACS)

Sommario

Cancro fibroblasti associati (CAF) facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione, l'angiogenesi, e l'infiammazione. Qui si descrive un metodo per isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF dal topo freschi e tessuti umani mediante selezione delle cellule, utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie.

Abstract

Cancro-associate fibroblasti (CAF) sono il tipo cellulare più prominente nello stroma del tumore di molti tumori, in particolare carcinoma mammario, e la loro presenza prominente è spesso associato con ^1,2 prognosi. CAF sono una sottopopolazione di fibroblasti attivati ​​stromali, molti dei quali esprimono il marcatore myofibroblast α-SMA ^3. CAF provengono da fibroblasti tissutali locali nonché da midollo osseo, cellule reclutati nel tumore sviluppare e adottare un fenotipo CAF sotto l'influenza del microambiente tumorale ^4. CAF sono stati dimostrato di facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione delle cellule tumorali, l'angiogenesi e l'invasione ^5-8. Abbiamo dimostrato che i CAF migliorare la crescita tumorale di mediazione che promuove l'infiammazione del tumore, a partire al più presto pre-neoplastiche stadi ^9. Nonostante la crescente evidenza dei CAF ruolo chiave svolgere nel facilitare la crescita tumorale,CAF studiano è una continua sfida a causa della mancanza di CAF-specifici marcatori e l'eterogeneità parte di queste cellule, con molti sottotipi coesistenti nel microambiente tumorale ^10. Inoltre, studiando fibroblasti in vitro è ostacolato dal fatto che il loro profilo di espressione genica è spesso alterato in coltura tissutale ^11,12. Per risolvere questo problema e per consentire imparziale profilo di espressione genica di fibroblasti di topo fresco e tessuti umani, abbiamo sviluppato un metodo basato sui protocolli precedenti per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) ^13,14. Il nostro approccio si basa su utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie per isolare i fibroblasti di topo freschi e tessuti umani. PDGFRα è abbondantemente espresso da entrambi i fibroblasti normali e CAF ^9,15. Questo metodo permette di isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF, tra cui, ma non limitato a α-SMA + attivato miofibroblasti. Fibroblasti isolati possono quindi essereutilizzati per la caratterizzazione e confronto dell'evoluzione di espressione genica che si verifica nei CAFS durante la tumorigenesi. In effetti, noi e gli altri segnalati profilo di espressione di fibroblasti isolati da cellule ordinamento ^16. Questo protocollo è stato eseguito con successo per isolare e creare un profilo popolazioni altamente arricchito di fibroblasti dai tessuti della pelle, della mammella, del pancreas e del polmone. Inoltre, il nostro metodo permette anche di coltura delle cellule filtrate, per eseguire esperimenti funzionali e per evitare contaminazione da cellule tumorali, che spesso è un grosso ostacolo quando si cerca di CAF cultura.

Protocollo

1. Dissezione tessuto mammario o con la pelle di topi

1. Prima di sezionare il tessuto desiderato dai topi, preparare le seguenti forniture e dei reagenti:

   Materiali di consumo:

   • Strumenti chirurgici (lavato con detergente e poi immersi in 70% etanolo).
   • Superficie di polistirolo per appoggiare il mouse su durante la dissezione.
   • Pins o aghi per tenere i topi durante la dissezione.
   • Vaso di vetro con coperchio per la digestione, contenente barra di agitazione magnetica (autoclave).
   • Bagnomaria a 37 ° C, contenente un agitatore magnetico sommergibile e acqua sufficiente per immergere il vaso....

Risultati

Utilizzando PDGFRα come marker risultati fibroblasti in isolamento delle popolazioni altamente arricchito di fibroblasti tissutali. Il livello di purezza dopo la cernita era del 99%, come quantificato mediante analisi post-liste (Figura 2A). Valutare la percentuale di contaminanti non fibroblasti cellule mediante l'espressione relativa di cellula-specifici geni di controllo (Figura 2B) mostra tipicamente 0,1-0,6% contaminazione. Questo livello di purezza permette di alta profilazion.......

Discussione

Mentre esperimenti condotti in coltura tissutale può essere informativo e suggerire principi funzionali che possono essere verificati in vivo, è noto che si verificano grandi cambiamenti nell'espressione genica di cellule in coltura ^11,12. Per evitare un passo coltura tissutale a profilare espressione genica in fibroblasti, abbiamo sviluppato un protocollo che permette di isolare normali, così come cancro-associate fibroblasti di topo freschi o tessuti umani. Questo protocollo è stato applicato c.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti (opzionale)
DMEM	Gibco	41965
PBS	Biologia Industries	02-023-1A
Collagenasi II	Worthington	LS4176
Collagenasi IV	Worthington	LS4188
Deoxyribonuclease	Worthington	LS2007
PharmLyse	BD	555899
Filtro cella 70 pm	SPL	93070
Purificato anti-topo CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
Via sonda (7AAD)	E-Bioscience	00-6993-50
Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRA)	E-Bioscience	12-1401-81
Anti-mouse FITC F4/80-	Cederlane	CL8940F
DMEM w / o Rosso fenolo	Gibco	31053
Collagene di tipo I	BD Biosciences	354236