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Inattivazione funzionale di espressione genica in cellule di mammiferi è fondamentale per lo studio del contributo di una proteina di interesse per varie vie 1,2. Tuttavia, knockdown condizionale dell'espressione genica è necessaria nei casi in cui knockdown costitutiva non è tollerata dalle cellule per un lungo periodo di tempo 3-5. Qui si descrive un protocollo per la preparazione di linee cellulari che permettono knockdown condizionale della subunità del fattore ACF rimodellamento della cromatina. Queste linee cellulari facilitare la determinazione del contributo di ACF ad induzione di morte cellulare per la proteina adenovirus E4orf4 6. Sequenze codificanti short hairpin RNA per le subunità ACF1 SNF2h e del fattore di ACF rimodellamento della cromatina sono stati clonati accanto a un doxiciclina promotore inducibile in un plasmide contenente un gene anche per il gene di resistenza alla neomicina. Neomicina resistenti cloni sono stati selezionati in presenza di G418 e isolata. Le linee cellulari risultanti sono state indottetrattamento doxiciclina, e una volta ACF1 o livelli di espressione SNF2h stati ridotti, le cellule sono state transfettate con un plasmide codificante E4orf4 o un vettore vuoto. Per confermare l'effetto specifico dei costrutti shRNA, i livelli di proteina ACF1 o SNF2h sono stati ripristinati ai livelli WT da coinfezione con un plasmide che esprime ACF1 o SNF2h cui erano stati resi resistenti al shRNA con l'introduzione di mutazioni silenti. La capacità di E4orf4 di indurre la morte cellulare nei vari campioni è stata determinata mediante un saggio DAPI, in cui è stata misurata la frequenza della comparsa di nuclei con morfologie apoptotici nella popolazione di cellule transfettate 7-9.
Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per la determinazione del contributo funzionale di varie proteine di induzione della morte cellulare dai loro partner proteici nei casi in cui knockdown costitutiva può essere letale cellula.