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Articolo metodologico

Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel

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DOI:

10.3791/4443

⸱

22 dicembre 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences and Institute for Neuroscience, George Washington University, 2Fred Hutchinson Cancer Research Center, 3Department of Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo una lettura molecolare di lungo termine dell'adattamento olfattivo Caenorhabditis elegans. La proteina chinasi G, EGL-4, è necessario per le risposte di adattamento stabili nella coppia primaria neurone sensoriale chiamato AWC. Durante prolungati odore di esposizione EGL-4 trasloca dal citosol al nucleo della AWC.

Abstract

Durante la stimolazione prolungata più neuroni sensoriali si adatterà la loro risposta diminuendo la loro sensibilità al segnale. La risposta di adattamento aiuta attenzione la forma e protegge anche le cellule provenienti da oltre-stimolazione. Adattamento nel circuito olfattivo di C. elegans è stato descritto da Colbert e Bargmann 1,2. Qui, gli autori hanno definito i parametri del paradigma adattamento olfattivo, che hanno usato per la progettazione di uno screening genetico di isolare mutanti difettosi nella loro capacità di adattarsi agli odori volatili rilevati dalle Amphid cellule alari di tipo C (AWC) neuroni sensoriali. Quando tipo selvatico C. elegans animali sono esposti a un interessante AWC-sentito odore 3 per 30 minuti che si adatterà la rispondenza alle l'odore e quindi ignorare l'odore adattando in un saggio di chemiotassi comportamentale per ~ 1 ora. Quando tipo selvatico C. elegans animali sono esposti a un interessante AWC-sentito odore di ~ 1 ora saranno quindi ignorare l'odore di adattare di achemotaxis test comportamentali per circa 3 ore. Queste due fasi di adattamento olfattivo in C. elegans sono stati descritti come breve termine l'adattamento olfattivo (indotta dopo 30 minuti di esposizione odore), ea lungo termine adattamento olfattivo (indotto dopo 60 minuti di esposizione odore). Più tardi lavorare da L'Etoile et al., 4 scoperto una proteina chinasi G (PKG) chiamato EGL-4 che è necessario sia per l'adattamento a breve e lungo termine nei neuroni olfattivo AWC. Il-4 EGL proteina contiene una sequenza di localizzazione nucleare che è necessario a lungo termine risposte di adattamento olfattive, ma non indispensabili per il breve termine, le risposte di adattamento olfattivo nel AWC 4. Taggando EGL-4 con una proteina fluorescente verde, è stato possibile visualizzare la localizzazione di EGL-4 nel AWC durante l'esposizione prolungata odore. L'utilizzo di questo completamente funzionale GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) molecola siamo stati in grado di sviluppare una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel AWC 5. Utilizzando questo mlettura olecular di adattamento olfattivo siamo stati in grado di eseguire entrambi gli schermi in avanti e all'indietro genetici per identificare gli animali mutanti che presentano i modelli difettosi localizzazione subcellulare di GFP :: EGL-4 nel AWC 6,7. Qui si descrive: 1) la costruzione di GFP :: EGL-4 animali che esprimono, 2) il protocollo per la coltivazione di animali a lungo termine saggi traslocazione odore indotta nucleari, e 3) il punteggio di lungo termine odore indotta traslocazione evento nucleare e il recupero (ri-sensibilizzazione) dal nucleare GFP :: EGL-4 Stato.

Protocollo

1. Costruzione di GFP Tagged EGL-4 Animali Esprimere

  1. Clonare il traslazionale fusione GFP :: EGL-4 sotto il promotore per l'ODR-3 gene (uso 2678 bp direttamente a monte del codone di inizio): (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. L'ODR-3 unità promotore espressione nelle coppie neurone amphid: AWA, AWB, AWC e debolmente in ASH.
  2. Iniettare il plasmide (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 in di tipo selvatico (N2) gli animali a 50 ng / mL con i co-iniezione utilizzando le normali marcatori della linea germinale tecniche di trasformazione 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / pl), e (p) ODR-1 :: DsRed 10 (25 ng / pl). L'ODR-1 espressione promotore unità nel AWC e AWB amphid coppie di neuroni, e la-1 ofm espressione promotore unità negli coelomocytes.
  3. Sottoporre gli animali transgenici che esprimono le matrici extracromosomici descritti al punto 1.2 per la ultravioletti (UV) / trimethylpsoralen (TMP), il protocollo di integrazione11.
  4. Bleach sincronizzare gli animali 12 e coltivarli in Nematode crescita media (NGM) piastre contenenti OP50 E. coli alla fase L4. Lavare L4 animali in piatti NGM con M9 tampone per rimuovere OP50 E. coli batteri.
  5. Rimuovere tampone M9 e aggiungere 50-100 ml di 30 mg / ml soluzione TMP lavoro sul verme pellet nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Avvolgere la provetta 1,5 ml in un foglio di bloccare la luce ambiente, e agitare delicatamente su un mixer per 15 minuti nella pellicola protettiva provetta 1,5 ml microcentrifuga. Trasferire i vermi nel TMP / worm soluzione ad un grande piatto NGM testa di serie.
  6. Esporre i vermi sulla piastra NGM ai raggi UV 350 μJ (X100) utilizzando un Stratalinker 2400. Quindi aggiungere i vermi ad una piastra contenente OP50 NGM e incubare al buio per 5 ore.
  7. Scegli 50 vermi transgenici a circa 10 piastre di teste di serie (2-5 vermi ogni piastra). Trasferimento P0 è a piatti nuovi ogni 24 ore per 3 giorni.
  8. Scegli 250 F1 clonale unnimals (1 animale per piastra). Clone out 2-4 animali F2 da F1 ogni piatto. Controllare animali F3 per cercare una linea di trasmissione 100% cercando in (p) ofm-1 :: pattern di espressione GFP sotto un microscopio da dissezione fluorescente.
  9. Outcross la riga finale integrato (s) con gli animali di tipo selvatico N2 5 volte. Si farà riferimento alla linea finale integrato di pyIs500, e la GFP-tagged EGL-4 molecola come GFP :: EGL-4.

2. La coltivazione e la manutenzione degli animali da saggi traslocazione nucleare

  1. Coltivate le pyIs500 animali a 25 ° C su piastre standard di 10 centimetri NGM (vedi sotto per ricetta) seminato con OP50 E. coli 13 (Figura 1).
  2. Il giorno 1, scegliere 4-5 L4 pyIs500 animali da piastre coltivate a 25 ° C su cinque distinti 10 centimetri OP50 E. coli seminato piastre e incubare a 25 ° C (cioè, L4 4-5 animali per piastra).
  3. Il giorno 4, lavare adulto populations di pyIs500 animali al largo delle piastre NGM di grandi dimensioni utilizzando S-basale del buffer (vedi sotto per ricetta). Utilizzare pipette in vetro usa e getta per trasferire gli animali, in quanto si attaccano al lato della puntali in plastica.

3. A lungo termine indotta Odore saggi traslocazione nucleare

  1. Lavare le pyIs500 animali 3 volte in S-basale per rimuovere i batteri. Non centrifugare animali tra un lavaggio, ma piuttosto permettere agli animali di stabilirsi per gravità in un fermo 1,5 ml microcentrifuga tubo. E 'fondamentale per garantire tutti i batteri viene rimosso, e che i paté NGM sono esenti da contaminazione, i batteri residui influenzerà negativamente l'esito del test traslocazione. Inoltre, abbiamo trovato che la sterilizzazione in autoclave le provette da 1,5 ml microcentrifuga produce una proprietà "appiccicoso" sulle pareti interne del tubo che causa gli animali di aderire alle pareti, ed utilizzare quindi non autoclave provette da 1,5 ml microcentrifuga.
  2. Mentre gli animali si stanno stabilendo tra un lavaggio, portare tegli adattamento soluzione. Aggiungere 100 ml di S-basale buffer su un cilindro graduato da 100 ml laurea. Aggiungi adattamento odore della S-basale e sigillare il cilindro con una striscia di parafilm. Se si esegue l'adattamento benzaldeide aggiungere 7,5 ml di benzaldeide a 100 ml di S-Basal, per l'adattamento butanone aggiungere 11 ml di 2-butaone a 100 ml di S-Basal. Capovolgere delicatamente (non agitare) il cilindro laurea contenente S-basali e l'odore 30 volte per creare una emulsione uniforme.
  3. Dopo l'ultimo lavaggio in S-basale, permettere agli animali di risolvere e rimuovere tutto il liquido. Etichettare una provetta "+ ve" o "adattare" e l'altro tubo "-ve" o "unadapt". Poi aggiungere 1 ml della miscela di adattamento alla provetta adattamento (+ ve), e aggiungere 1 ml di S-basale al tubo disadattato microcentrifuga di comando (-ve). Cercate di mantenere il numero di animali tra 100 e 200 in ciascun tubo. Con una certa pratica, è possibile stimare il numero approssimativo di animali in un pellet ad occhio.
  4. Inserire un 1,5 ml microcentrifuga tubo tappo di protezionead ogni provetta (impedisce coperchi da aperto popping) e posizionare i tubi su un rotatore per 80 min. Abbiamo trovato che l'esposizione odore tra 60 min e 80 min produce risultati simili (sia risultato a lungo termine risposte di adattamento). Tuttavia, l'80 minuti di esposizione offre risultati più coerenti nelle nostre mani. Quindi tutti i nostri saggi a lungo termine di adattamento sono standardizzati utilizzando un odore di esposizione 80 min (Figura 2).
  5. Dopo 80 minuti, lavare gli animali 3 volte in S-basale. Consentire agli animali di risolvere per gravità tra ogni lavaggio.

4. A breve termine Odore indotte saggi traslocazione nucleare

  1. In caso di breve termine dell'adattamento odore, utilizzare lo stesso protocollo per lungo termine saggi traslocazione odore indotte (Fasi 3,1-3,4), ma invece di incubazione delle pyIs500 animali nell'adattare odori per 80 min, utilizzare una esposizione 30 min . La quantificazione di odore indotte saggi traslocazione nucleare descritta di seguito (Passaggio 5) è lo stesso per lungo e breve term esposizioni.

5. Segnare l'Odore indotto degli eventi nucleari Traslocazione

  1. Fai 2% pastiglie agarosio contenenti 5 mM sodio azide (NaN 3) sciogliendo elettroforesi su gel di agarosio in dH 2 0. Mettere una goccia di agarosio fuso contenente NaN 3 su un vetrino per microscopio. Porre immediatamente un altro vetrino da microscopio di vetro sulla prima diapositiva per appiattire la goccia di agarosio fuso. Lasciare agire per 30 secondi, e poi delicatamente prendere in giro a parte la vetrini lasciando un vetrino da microscopio con un tampone piatto agarosio di circa 1 mm.
  2. Dopo l'ultimo lavaggio in S-basale, permettere ai vermi di stabilirsi nel tubo 1,5 ml microcentrifuga e rimuovere tutto il liquido. Quindi aggiungere gli animali goccia a goccia sui pad agarosio di vetrini da microscopio diversi. E 'importante mantenere il numero di animali per ogni diapositiva a tra 50 e 100. Troppi animali per vetrino si complicano punteggio e spesso creano un bagliore spargendo dopo blu-luce di eccitazione. Liquido in eccesso puòessere cattivi dai pad agarosio con un piccolo Kim-wipe. Collocare un bicchiere 0,5 millimetri copertura antiscivolo sul tampone e lasciare riposare per 2 min per consentire l'NaN 3 per immobilizzare gli animali. Nota, gli animali possono essere recuperato presso le diapositive dopo aver segnato. Gli animali si riprenderà dal 3 NaN anestetico dopo ~ 1 ora in caso di cessione di una piastra NGM seminato in una goccia di tampone M9.
  3. A questo punto è indispensabile che ogni sperimentatore elaborare una chiave per tenere traccia che scorrono è sperimentale (+ ve) diapositiva e che scorrono è il controllo (-ve) slitta, e passare le diapositive ad un'altra persona che ciecamente segnerà il GFP: EGL-4 modello di localizzazione. Ciò permette di controllare per ogni pregiudizio sperimentatore.
  4. Punteggio compreso tra 50 e 100 capi per vetrino utilizzando un microscopio a fluorescenza in posizione verticale con gli obiettivi di ingrandimento 10X, 40X e 63X e GFP / RFP filtri. In primo luogo, individuare gli animali a 10 ingrandimenti con campo chiaro illuminazione. In secondo luogo, individuare il neurone AWC spegnendo il bright-campo di illuminazione e utilizzando il filtro RFP. I (p) ODR-1 :: unità DsRed espressione in AWB e neuroni AWC. I neuroni hanno AWC distintivi corpi cellulari di forma ovale rispetto AWB corpi cellulari che sono più piccoli e di forma circolare (Figura 2).
  5. Una volta che il corpo cellulare AWC è stato localizzato, passare al filtro GFP e registrare la localizzazione di GFP: EGL-4 come nucleare o citoplasmatico. Utilizzando un contatore permette di mantenere lo sperimentatore guardare nell'oculare mentre segnando la diapositiva. Nota: 5,1-5,5 passaggi vengono ripetuti almeno 3 volte in giorni diversi per ottenere dati statisticamente significativi (figure 1-2).

6. Il monitoraggio GFP-tagged EGL-4 durante il recupero da lungo termine adattamento Odore

  1. Passo dopo 3,5, dividere le popolazioni di animali pyIs500 in aliquote multiple e punteggio per GFP nucleare rispetto citoplasmatica :: EGL-4 nel AWC punto al tempo zero (cioè, dopo 80 minuti di esposizione) ed multiple punti temporali successivi (Figura 3).
  2. Trasferire sia il controllo (-ve) e sperimentali (+ ve) animali con pipette in vetro usa e getta su piastre NGM.
  3. Consentire agli animali di recuperare per varie lunghezze di tempo e di riesaminare la localizzazione di GFP :: EGL-4in AWC ad ogni tempo, come nei passaggi 5,1-5,5.

7. Materiale

Piastre NGM: Per 1 L aggiungere a 1 L DDH 2 0: 21 g Bacto-agar, 3 g Cloruro di sodio (NaCl), 2,5 g Bacto-peptone. Autoclave Media. Dopo la sterilizzazione in autoclave, raffreddare l'agar fino a quando la temperatura indica 54 ° C. Aggiungere le seguenti soluzioni: 25 ml 1M tampone fosfato di potassio, 1 ml 1 M di solfato di magnesio (MgSO4), 1 ml 1 M di cloruro di calcio (CaCl 2); 1 colesterolo ml in etanolo (5 mg / ml di brodo).

1 M bibasico K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Per 500 ml: In 400 ml DDH 2 O, sciogliere 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Regolare il volume a 500 L con DDH 2 O. Filtrare sterilizzare con un 500 ml Unità di filtro sterile.

1 M monobasico di KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Per 1 L: In 800 ml DDH 2 O, sciogliere 136,1 g monobasico di KH 2 PO 4. Regolare il volume a 1 L con DDH 2 O. Filtrare sterilizzare con un 500 ml Unità di filtro sterile.

1 M fosfato di potassio (K 3 PO 4) pH 6.0: Per 1 L: In una unità 1 L filtro sterile, aggiungere 868 ml di 1 M monobasico di KH 2 PO 4. Permettere all'unità di filtrare, poi aggiungere 132 ml di 1 M bibasico K 2 HPO 4. Permettere all'unità di filtrare tutto il liquido. Rimuovere l'unità di filtro e aggiustare il pH a 6,0. Conservare a temperatura ambiente.

S-basale: Per 1 L: aggiungere 50 ml 1M K 3 PO 4 tampone, pH ~ 6.0, e 20 ml di NaCl 5M aq. Riempire a 1 L conDDH 2 O. Autoclave soluzione.

M9: Per 1 L: 3 g KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O. Riempire a 1 L con DDH 2 0. Sterilizzare in autoclave.

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Risultati

Un esempio del modello di localizzazione GFP :: EGL-4in l'AWC prima e dopo esposizione prolungata odore è mostrato in Figura 2. Prima dell'esposizione prolungata odore, GFP :: EGL-4 è localizzato al citosol della AWC (Figura 2B), e dopo 80 minuti di esposizione GFP odore :: EGL-4 è localizzata nel nucleo della AWC (Figura 2D). A livello comportamentale, gli animali con citosolica GFP :: EGL-4 in AWC sono attratti da una sorgente puntiforme di odore (Figu...

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Discussione

L'odore indotta ingresso nucleare di GFP-tagged EGL-4 molecola qui descritta fornisce una lettura solida molecolare di adattamento olfattivo in C. elegans. L'odore indotte saggi traslocazione nucleare sono semplici e richiedono solo pochi giorni di tempo di preparazione. Il pyIs500 animale che abbiamo costruito per questi test, esprime un marcatore che illumina il neurone AWC oltre ad esprimere la GFP-tagged EGL-4 proteine. Pertanto, riteniamo che uno sperimentatore con poca o nessuna esperienz...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Scott Hamilton, ed i membri del laboratorio di O'Halloran per la lettura attenta di questo manoscritto. Ringraziamo anche il nostro anonimo recensore per eccellenti suggerimenti e commenti penetranti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti
Bacto Agar Difco DF0140-07-4 NGM piastre
Cloruro di sodio Fisher Chemical S671-10 NGM piastre
Bacto Peptone Difco DF0118-07-2 NGM piastre
Fosfato di potassio bibasico Fisher Chemical S375-500 S-Basal buffer e piastre NGM
Potassio fosfato monobasico Fisher Chemical P285-500 S-Basal buffer e piastre NGM
Kimwipes - Piccolo Kimberly-Clark LS2770
Etanolo 100% Gold Shield chimicaCo. 43196-115 odori diluizione per saggi di chemiotassi
Cloruro di calcio Sigma-Aldrich C8106-500G NGM piastre
Magnesio solfato MP Biomedicals 150136-500G NGM piastre
Sodio azide 99% Fisher Scientific ICN10289180 Anestetico
Agarosio - ultrapura Invitrogen 16500-500 Agarosio pastiglie
Benzaldeide Sigma-Aldrich B1334-100G Odore AWC
Butanone, ACS grado Sigma-Aldrich 360473-500ML Odore AWC
Tubi - microcentrifuga 1,5 ml colorati Denville LS8147
Pipettare Pasteur monouso in vetro 5-3/4 " Fisher Scientific 13-678-20B
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 Integrazione UV
Filtrare sotto vuoto bottiglia - 500 ml Nalgene 09-740-25B

Riferimenti

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