Articolo metodologico

Espianti blastomero al test per l'Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

DOI:

10.3791/4458

⸱

26 gennaio 2013

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1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Anatomy and Regenerative Biology, The George Washington University

In questo articolo

Sommario

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Il destino di una singola cellula embrionale può essere influenzata da molecole ereditarie e / o da segnali provenienti da cellule vicine. Utilizzando mappe destino dell'embrione stadio di segmentazione del Xenopus, singoli blastomeri possono essere identificati per la cultura in isolamento per valutare i contributi di molecole ereditarie rispetto interazioni cellula-cellula.

Abstract

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Mappe destino, costruiti lineage tracing tutte le cellule di un embrione, rivelano che i tessuti discendere da ciascuna cellula dell'embrione. Sebbene le mappe destino sono molto utili per identificare i precursori di un organo e per chiarire il percorso di sviluppo da cui le cellule discendenti popolano quell'organo nell'embrione normale, non illustrano il potenziale di sviluppo di una cellula precursore o identificare i meccanismi con cui il suo destino è determinato. Per eseguire il test per l'impegno il destino delle cellule, si confrontano normale repertorio di una cellula di discendenti nell'embrione intatto (la mappa destino) con quelli espressi dopo una manipolazione sperimentale. E 'il destino della cellula fissa (impegnato) indipendentemente dall'ambiente circostante cellulare, o è influenzato da fattori esterni, forniti dai suoi vicini? Utilizzando le mappe complete destino dell'embrione Xenopus, si descrive come identificare, isolare e cultura singoli precursori stadio scissione, chiamato blastomeres. Questo approccio permette di valutare se queste cellule precoci sono impegnati nel fato che acquistano nel loro ambiente normale nell'embrione intatta, richiedono interazioni con le loro cellule vicine, o possono essere influenzate esprimere sorti alterne se esposto ad altri tipi di segnali.

Introduzione

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Xenopus laevis embrioni sono stati utilizzati ampiamente per identificare i meccanismi con cui le cellule embrionali acquisiscono i loro destini, poichè le loro uova sono grandi abbastanza da permettere approcci microchirurgiche. Inoltre, si sviluppano esternamente senza la necessità di integrazione nutrizionale del terreno di coltura in quanto ogni cella contiene una ricca intracellulare di piastrine tuorlo che forniscono un negozio intrinseca energia. Un elemento importante per lo studio dei meccanismi attraverso i quali si determina il destino della cellula è la serie completa di mappe destino dei blastomeri fase a scissione (da 2 - a 32 celle stadi)

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Protocollo

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1. Preparazione di terreni di coltura, strumenti e piatti

  1. Contrasta con quattro pinze Alumina pellicola abrasiva. Fate questo sotto un microscopio da dissezione per monitorare la grandezza della punta. Una coppia di pinze serve come back-up in caso di una punta è danneggiata durante la procedura. Autoclavare tutte e quattro le pinze e conservare in un contenitore sterile.
  2. Fai 500 ml ciascuna di terreno di coltura e di 0,1 X. 1.0X (sia di Marc Ringers Modified [MMR] o modifica di Barth Saline [MBS], ricette in 15) e filtro sterilizzare. Noi abitualmente uso MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO4,....

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Risultati

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La capacità di questo test per valutare con precisione il potenziale di sviluppo della cellula si basa su sezionando il blastomero corretta in base al destino mappe 1, 2, 3, 4, 5, 6. Pertanto, è fondamentale scegliere embrioni con il pattern pigmentazione corrette al 2-cellula fase, come illustrato nella figura 1, che successivamente sono conformi ai modelli di scissione regolari, come illustrato nella figura 2. Se si osservano gli embrioni classificate come non giungono alla.......

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Discussione

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Le fasi più critiche per la coltivazione di successo di singoli blastomeri sono: 1) identificare correttamente il blastomero di interesse; 2) il mantenimento di una sterile, sana cultura; 3) le cellule dissezione presso la parte corretta del ciclo cellulare e 4) a sviluppare la manualità necessaria destrezza per evitare danni durante la dissezione e trasferire alla cultura bene.

Per manipolare blastomeri specifici, è essenziale essere in grado di identificare gli assi cardinali. In embrioni .......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare il GWU Harlan Fellowship per il supporto di Paaqua Grant e il GWU Luther Rice Fellowship per il supporto di Mona Herold. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation concessione MCB-1121711.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti (opzionale)
Alumina pellicola abrasiva Thomas Scientific # 6775E-38 Corso (12 micron), per riparazioni importanti consigli di forcipe
Alumina pellicola abrasiva Thomas Scientific # 6775E-46 Medio (3 micron), per fini affilatura di punte Pinza
Alumina pellicola abrasiva Thomas Scientific # 6775E-54 Fine (0,3 micron), per la lucidatura di punte Pinza
Pinza: Dumont, Dumoxel Biologie # 5 Strumenti Scienza Belle # 11252-30 Questi hanno le punte sottili che non hanno bisogno di affilatura al primo acquisto. Resistente alla corrosione in modo che possanoessere sterilizzati in autoclave.
Gentamicina soluzione Sigma G1397 Aggiungi ai media il giorno stesso in cui l'uso

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
  2. Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
  3. Moody, ....

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Blastomere ExplantCell Fate CommitmentXenopus EmbryoFate Map AnalysisSingle Cell IsolationEmbryonic DissectionIn Situ HybridizationGene Expression AnalysisDevelopmental Potential AssessmentNeural Fate Testing

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