Espressione ectopica è una tecnica per chiarire il ruolo microRNA nello sviluppo del cervello. Tuttavia, il targeting aree specifiche utilizzando in elettroporazione ovo è impegnativo. Qui vi mostriamo un modo efficiente alle regioni mesencefalo ventrale e dorsale in modo selettivo l'elettroporazione.
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Articolo metodologico
In Expression Ovo di MicroRNA in Ventrale Chick Mesencefalo
In questo articolo
Sommario
Abstract
RNA non codificanti sono altri giocatori nella regolazione dell'espressione genica. Mirata in elettroporazione ovo di settori specifici fornisce uno strumento unico per il controllo spaziale e temporale di espressione microRNA ectopica. Tuttavia, le strutture cerebrali ventrali come mesencefalo ventrale sono piuttosto difficili da raggiungere per eventuali manipolazioni. Qui, dimostriamo un modo efficiente per l'elettroporazione di miRNA nel mesencefalo ventrale con elettrodi di platino sottili. Questo metodo offre un modo affidabile per trasfettare aree specifiche del mesencefalo e uno strumento utile per studi in vivo.
Introduzione
Il riconoscimento di piccoli RNA non codificanti come lettori aggiuntivi per l'espressione genica ha lanciato una nuova complessità genomica regolamento programmazione / gene. Diverse specie di RNA non codificanti hanno importanza funzionale in cellule neurali, comprese le piccole non codificanti RNA 1-4. I microRNA (miR o miRNA), per esempio, mostrano profili di espressione distinti e mutevoli nel cervello in via di sviluppo 5. Mirata in elettroporazione ovo di embrioni di pollo offre un'opportunità unica per il controllo spaziale e temporale di espressione genica e silenziamento durante lo sviluppo.
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Protocollo
1. Requisiti per In ovo Elettroporazione
- Preparazione del costrutto vettore: miR senso e antisenso primer sono stati progettati dopo le istruzioni del Ambion, ricotte e legato in ApaI / EcoRI digerito pSilencer U6.1 vettoriale. Dopo trasformazione di successo uno dei cloni risultanti stata coltivata e pSilencer plasmide è stato isolato mediante metodo di lisi alcalina utilizzando un kit di preparazione midi Quiagen.
- Elettrodi: Gli elettrodi possono essere acquistati o facilmente essere costruite 13. Usiamo elettrodi self-made di filo di platino (Φ = 0.2, 0.25, o 0,5 millimetri di diametro) o i....
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Risultati
L'estensione dell'area mesencefalo trasfettate con miR è visibile attraverso l'espressione di GFP da un vettore giornalista iniettato insieme al miR esprimendo vettore (Figura 2). Utilizzando elettrodi di platino con un diametro di 0,5 mm e collocato parallelamente all'asse AP di porta mesencefalo normalmente alla trasfezione di una vasta area lungo la-DV e AP-asse, compresi hindbrain, mesencefalo e talvolta diencefalo (Figure 2A e B). Le dimensioni degli elettrodi risul.......
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Discussione
Questo video mostra un metodo efficace per trasfettare plasmide nelle cellule neuroepiteliale di aree specifiche del mesencefalo pulcino. Impulsi elettrici rettangolari di bassa tensione possono introdurre DNA in cellule del tubo neurale pulcino in ovo 6,16. Tuttavia, la precisione di targeting DNA è spesso ostacolata dal campo elettrico ampia, che sale attraverso le relativamente grandi elettrodi (Φ = 0,5 mm). Abbiamo cercato di affrontare questo problema utilizzando elettrodi più piccoli di diametr.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo K. Mikic, che ha contribuito alla fase iniziale di questo film e M. Nicolescu per l'immagine miR. C. Huber è stato sostenuto da una borsa di studio del IZKF del Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand dal programma fortuna del Universtitätsklinikum Tubinga.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Capillari in vetro borosillicato | Hartenstein | Modello: 0,9 mm | |
| Estrattore microcapillare | WPI, Berlino | Modello: Pul1-E | |
| Elettroporatore | Intracel | Modello: TSSIC | |
| Stereomicroscopio - fluorescenza | LEICA | Modello: MZFLIII | |
| Stereomicroscopio | Zeiss | Modello: Stemi | |
| Fotocamera e software | Zeiss | Modello: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
Riferimenti
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18....
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Ristampe e permessi
