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Gli organi interni come il cuore, il cervello, e nell'intestino sviluppare sinistra-destra (LR) asimmetrie che sono fondamentali per le loro normali funzioni 1. Ciglia mobili sono coinvolti nella creazione LR asimmetria negli embrioni dei vertebrati, tra cui mouse, rana, e zebrafish 2-6. Questi 'cilia LR "generano flusso asimmetrico fluido che è necessario per attivare una conservata asimmetrica Nodal (TGF-β superfamiglia) di segnalazione cascata nel mesoderma piastra laterale sinistra, che è pensato per fornire informazioni patterning LR per lo sviluppo di organi 7. Così, per comprendere i meccanismi sottostanti patterning LR, è essenziale per identificare i geni che regolano l'organizzazione delle cellule ciliate LR, la motilità e la lunghezza delle ciglia LR e la loro capacità di generare robusto flusso asimmetrico.
In zebrafish, ciglia LR si trovano in vescicole di Kupffer (KV) 2,4,5. KV è costituito da un singolo strato di cellule epiteliali monociliatedche racchiudono un lume piene di liquido. Mappatura destino KV ha dimostrato che è derivato da un gruppo di ~ 20-30 cellule conosciute come cellule precursore dorsali (DFCS) che migrano al margine blastoderm dorsale durante fasi epiboly 8,9. Durante le fasi iniziali somite, cluster DFCS e differenziarsi in cellule epiteliali ciliate per formare KV nel tailbud dell'embrione 10,11. La capacità di identificare e tenere traccia di DFCS-in combinazione con trasparenza ottica e il rapido sviluppo del pesce zebra dell'embrione-make zebrafish KV un sistema ottimo modello per studiare le cellule ciliate LR.
È interessante notare che, progenitori della DFC / KV linea cellulare mantenere ponti citoplasmatici tra la cellula uovo fino a 4 ore post-fecondazione (HPF), mentre ponti citoplasmatici tra la cellula uovo e altre cellule embrionali vicino dopo 2 HPF 8. Approfittando di questi ponti citoplasmatici, abbiamo sviluppato una fase specifica strategia di iniezione per fornire morfolino oligonucleotides (MO) esclusivamente a DFCS smontabili e la funzione di un gene mirato in queste cellule 12. Questa tecnica crea embrioni chimerici in cui viene buttato funzione genica giù nella DFC / KV lignaggio sviluppare nel contesto di un embrione wild-type. Per analizzare il flusso asimmetrico fluido in KV, iniettiamo microsfere fluorescenti nel lume KV e movimento del disco perlina con videomicroscopia 2. Flusso del fluido è facilmente visualizzato e può essere quantificata inseguimento spostamento tallone nel tempo.
Qui, con lo stadio-specifico DFC-targeting tecnica knockdown gene e iniezione di microsfere fluorescenti in KV per visualizzare il flusso, presentiamo un protocollo che fornisce un approccio efficace per caratterizzare il ruolo di un particolare gene durante lo sviluppo e la funzione KV.