In questo protocollo, dimostriamo la fabbricazione di substrati di coltura cellulare cardiaca biomimetica realizzati con due materiali polimerici distinti utilizzando la litografia a forza capillare. I metodi descritti forniscono una tecnica scalabile ed economica per ingegnerizzare la struttura e la funzione dei tessuti cardiaci macroscopici per applicazioni in vitro e in vivo.
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Articolo metodologico
Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malattia cardiovascolare resta la principale causa di morte nel mondo 1. Ingegneria tissutale cardiaca molto promettente per fornire scoperte mediche rivoluzionarie con gli obiettivi di sviluppo di tessuti funzionali per la rigenerazione cardiaca, così come test di screening in vitro. Tuttavia, la capacità di creare modelli ad alta fedeltà di tessuto cardiaco è rivelato difficile. Matrice extracellulare del cuore (ECM) è una struttura complessa costituita da entrambi i segnali biochimici e biomeccanici che vanno dalla micro-alla scala nanometrica 2. Locali condizioni di carico meccanico e le interazioni cellula-ECM sono stati recentemente riconosciuti come componenti vitali in ingegneria del tessuto cardiaco 3-5.
Una gran parte della ECM cardiaco è composto da fibre di collagene allineate con diametri scala nanometrica che influenza significativamente l'architettura dei tessuti e accoppiamento elettromeccanico 2. Purtroppo, alcuni metodi have stato in grado di mimare l'organizzazione delle fibre ECM fino alla scala nanometrica. Recenti progressi nelle tecniche di nanofabbricazione, tuttavia, hanno permesso la progettazione e la realizzazione di ponteggi scalabili che imitano i segnali vivo rigidità strutturali e substrato della ECM nel cuore 6-9.
Presentiamo qui lo sviluppo di due riproducibile, processi nanopatterning scalabili per l'allineamento funzionale delle cellule cardiache utilizzando la poli polimero biocompatibile (lattide-co-glicolico) (PLGA) 8 e un poliuretano (PU) polimero a base conveniente, e. Questi substrati anisotropicamente nanofabricated (ANF) imitare la ECM sottostante ben organizzate, tessuti allineati e può essere utilizzato per studiare il ruolo di nanotopography sulla morfologia e la funzione delle cellule 10-14.
Utilizzando un nanostrutturati (NP) maestro di silicio come un modello, un acrilato di poliuretano (PUA) muffa è fabbricato. Questo stampo PUA viene quindi utilizzato per pattern l'idrogel PU o PLGA tramite solventi mediata litografia forza capillare (CFL)-UV assistita o, rispettivamente, 15,16. In breve, PU o PLGA pre-polimero è caduta erogato su un vetrino di vetro e lo stampo PUA è posto sulla parte superiore. Per CFL-UV assistita, il PU viene poi esposto a radiazioni UV (λ = 250-400 nm) per la polimerizzazione. Per mediata solvente CFL, il PLGA viene stampato mediante calore (120 ° C) e pressione (100 kPa). Dopo la polimerizzazione, lo stampo PUA è staccata, lasciando dietro un ANF per coltura cellulare. Pile, come neonatali miociti ventricolari di ratto, così come cardiomiociti derivati dalle cellule staminali umane pluripotenti, possono essere mantenuti in ANF 2.
Introduzione
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità nel mondo e presentare un pesante fardello socio-economico su un già tesa globale 1,17 sistema sanitario. Ingegneria tissutale cardiaca ha due obiettivi distinti: (1) per rigenerare il miocardio danneggiato dopo la malattia ischemica o cardiomiopatia o (2) per creare un modello ad alta fedeltà del cuore per lo screening in vitro di droga o di modellazione malattia.
Il cuore è un organo complesso che deve lavorare costantemente per la fornitura di sangue al corpo. Strutture laminari densamente di cardiomiociti e tessuti di sostegno sono dispos....
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Protocollo
Tutte le procedure sono condotte a temperatura ambiente (~ 23 ° C), salvo diversamente indicato.
1. Fabbricazione di Silicon Maestro
- Pulire wafer di silicio con 100% di etanolo o xilene e secco sotto O 2 / N 2 gas.
- Posizionare wafer di silicio in spin-coater a velocità di rotazione di 2.000-4.000 rpm per produrre un film di spessore 0,3-0,5 micron.
- Reticolo la pellicola di fotoresist con le dimensioni corrette utilizzando un sistema di fotolitografia
- Immergere completamente le fette di silicio photoresist rivestite con fantasia in un volume appropriato di soluzione photoresist....
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Risultati
La figura 1 è uno schema del processo di produzione per i due metodi di fabbricazione. A causa della diffrazione della luce causata dalla topografia nanoscala, nanopatterning dovrebbe risultare in una superficie iridescente alla ANF. Figura 2 mostra questa superficie iridescente su un ben modellata-25 millimetri coprioggetto NP-PU (Figura 2A) con cresta 800 nm e scanalatura larghezza (Figura 2B). L'aspetto iridescente della ANF varierà leggermente a.......
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Discussione
Tessuti cardiaci funzionalmente maturi sono carenti sia in vivo che in vitro applicazioni di ingegneria tissutale cardiaco. I metodi di nanofabbricazione CFL qui descritte sono tecniche robuste per realizzare l'allineamento cellulare e influenzare la funzione del tessuto macroscopico dovuto alla scalabilità del sistema. Grandi aree possono essere facilmente modellati e utilizzati per la coltura cellulare. Macroscopico allineamento cellulare è essenziale in ingegneria tessuto cardiaco per creare biomimetico,.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
D. H. Kim ringrazia il Dipartimento di Bioingegneria dell'Università di Washington per il nuovo fondo per l'avvio della facoltà. D. H. Kim è anche supportato dal Perkins Coie Award for Discovery, dal Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, dal Washington State Life Science Discovery Fund e dall'American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang e A. Jiao ringraziano il supporto del NIH Bioengineering Borsa di studio per la formazione cardiovascolare. Un ulteriore sostegno per questo lavoro proviene dalla sovvenzione del National Institutes of Health (NIH) R01HL111197 a M. Regnier.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fibronectina | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Promotore di adesione superficiale (primer per vetro) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Rullo in gomma morbida | Speedball | ||
| Wafer di silicone | NOVA Materiali elettronici | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Sistema di litografia a fascio di elettroni | JEOL | JBX-9300FS | |
| Sistema di incisione | di tecnologia di superficie | NP10 8UJ | |
| Sistema di asher al plasma | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Sistema di cura dell'ozono | Minuta Tech | MT-UV-O-08 | |
| Sistema di polimerizzazione per fusione | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater Laurel | Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| Vetrini da 25 mm | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Kit di elastomeri siliconici | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poli (D,L-lattide-co-glicolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Cloroformio | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500 g Pesi | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Alcool isopropilico | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Piastra riscaldante | Corning | PC-420D | |
| Sonicatore Branson | B2510MTH |
Riferimenti
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
- Kim, D. -H., et al.
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Ristampe e permessi
