Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Summary

In questo protocollo, dimostriamo la fabbricazione di substrati di coltura cellulare cardiaca biomimetica realizzati con due materiali polimerici distinti utilizzando la litografia a forza capillare. I metodi descritti forniscono una tecnica scalabile ed economica per ingegnerizzare la struttura e la funzione dei tessuti cardiaci macroscopici per applicazioni in vitro e in vivo.

Abstract

La malattia cardiovascolare resta la principale causa di morte nel mondo ^1. Ingegneria tissutale cardiaca molto promettente per fornire scoperte mediche rivoluzionarie con gli obiettivi di sviluppo di tessuti funzionali per la rigenerazione cardiaca, così come test di screening in vitro. Tuttavia, la capacità di creare modelli ad alta fedeltà di tessuto cardiaco è rivelato difficile. Matrice extracellulare del cuore (ECM) è una struttura complessa costituita da entrambi i segnali biochimici e biomeccanici che vanno dalla micro-alla scala nanometrica ^2. Locali condizioni di carico meccanico e le interazioni cellula-ECM sono stati recentemente riconosciuti come componenti vitali in ingegneria del tessuto cardiaco ^3-5.

Una gran parte della ECM cardiaco è composto da fibre di collagene allineate con diametri scala nanometrica che influenza significativamente l'architettura dei tessuti e accoppiamento elettromeccanico ^2. Purtroppo, alcuni metodi have stato in grado di mimare l'organizzazione delle fibre ECM fino alla scala nanometrica. Recenti progressi nelle tecniche di nanofabbricazione, tuttavia, hanno permesso la progettazione e la realizzazione di ponteggi scalabili che imitano i segnali vivo rigidità strutturali e substrato della ECM nel cuore ^6-9.

Presentiamo qui lo sviluppo di due riproducibile, processi nanopatterning scalabili per l'allineamento funzionale delle cellule cardiache utilizzando la poli polimero biocompatibile (lattide-co-glicolico) (PLGA) ⁸ e un poliuretano (PU) polimero a base conveniente, e. Questi substrati anisotropicamente nanofabricated (ANF) imitare la ECM sottostante ben organizzate, tessuti allineati e può essere utilizzato per studiare il ruolo di nanotopography sulla morfologia e la funzione delle cellule ^10-14.

Utilizzando un nanostrutturati (NP) maestro di silicio come un modello, un acrilato di poliuretano (PUA) muffa è fabbricato. Questo stampo PUA viene quindi utilizzato per pattern l'idrogel PU o PLGA tramite solventi mediata litografia forza capillare (CFL)-UV assistita o, rispettivamente, ^15,16. In breve, PU o PLGA pre-polimero è caduta erogato su un vetrino di vetro e lo stampo PUA è posto sulla parte superiore. Per CFL-UV assistita, il PU viene poi esposto a radiazioni UV (λ = 250-400 nm) per la polimerizzazione. Per mediata solvente CFL, il PLGA viene stampato mediante calore (120 ° C) e pressione (100 kPa). Dopo la polimerizzazione, lo stampo PUA è staccata, lasciando dietro un ANF per coltura cellulare. Pile, come neonatali miociti ventricolari di ratto, così come cardiomiociti derivati ​​dalle cellule staminali umane pluripotenti, possono essere mantenuti in ANF ^2.

Introduction

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità nel mondo e presentare un pesante fardello socio-economico su un già tesa globale ^1,17 sistema sanitario. Ingegneria tissutale cardiaca ha due obiettivi distinti: (1) per rigenerare il miocardio danneggiato dopo la malattia ischemica o cardiomiopatia o (2) per creare un modello ad alta fedeltà del cuore per lo screening in vitro di droga o di modellazione malattia.

Il cuore è un organo complesso che deve lavorare costantemente per la fornitura di sangue al corpo. Strutture laminari densamente di cardiomiociti e tessuti di sostegno sono disposti in schemi elicoidali tutta la parete cardiaca ^18,19. Il cuore è anche accoppiato elettromeccanico ²⁰ in un modo altamente coordinato per espellere efficacemente sangue al corpo ^21. Diversi ostacoli principali restano da affrontare, tuttavia, prima intricato disegno della natura può attendibilmente essere ricapitolato in vitro.In primo luogo, anche se robusti metodi di differenziazione dei cardiomiociti continuano ad essere sviluppato ^22, HPSC-CM esporre ancora fenotipi piuttosto immaturi. Le loro proprietà elettromeccaniche e la morfologia più strettamente corrispondono livelli fetali ^23. In secondo luogo, se tenuto in condizioni di coltura tradizionali, sia derivato dalle cellule staminali e cardiomiociti primari non riescono ad assemblare in strutture native, tessuto-like. Piuttosto, le cellule diventano orientati in modo casuale e non presentano l'aspetto a forma di bastoncino fasciato di miocardio adulto ^24.

La matrice (ECM) ambiente extracellulare con cui le cellule interagiscono gioca un ruolo importante in numerosi processi cellulari ^11,13,25. L'ECM consiste di complessi segnali molecolari e topografici, ben definiti che influenzano significativamente la struttura e la funzione delle cellule ^6,26. All'interno del cuore, l'allineamento cellulare segue da vicino le fibre ECM sottostante scala nanometrica ^2. L'impatto di questi nanotopographspunti iCal sul cellulare e la funzione del tessuto, tuttavia, è ben lungi dall'essere completamente capito. Studi preliminari di interazione cellula-biomateriale scala nanometrica indicano la potenziale importanza e l'impatto di sub-micron spunti topografici per la segnalazione cellulare ^{27, 28-30} adesione, la crescita ^{del 31,} e la differenziazione ^32,33. Tuttavia, a causa della difficoltà di sviluppare substrati nanofabricated riproducibili e scalabile, tali studi potrebbero non riprodurre gli effetti cellulari multi-scala del complesso in ambiente ECM vivo. In questo protocollo, una tecnica di nanofabbricazione semplice e conveniente per produrre scaffold di coltura cellulare che mimano allineamento delle fibre ECM cardiaca nativa è descritto, consentendo una vasta gamma di nuove ricerche di interazioni cardiomiociti-biomateriale. Capire come cardiomiociti interagiscono con l'ambiente ECM nanoscala potrebbe consentire per la capacità di controllare il comportamento cellulare per imitare più da vicino funzioni tessuto nativozione. Inoltre, monostrati cellulari sono un sistema sperimentale semplificato rispetto a strutture 3D, ma ancora presentano un comportamento multicellulare complesso per le indagini penetranti e screening funzionale ^2,34-36. Infine, tali impalcature potrebbero essere utilizzati per migliorare la funzione del trapianto cellulare quando impiantato nel cuore per fini rigenerativi ^37.

Protocol

Tutte le procedure sono condotte a temperatura ambiente (~ 23 ° C), salvo diversamente indicato.

1. Fabbricazione di Silicon Maestro

1. Pulire wafer di silicio con 100% di etanolo o xilene e secco sotto O ₂ / N ₂ gas.
2. Posizionare wafer di silicio in spin-coater a velocità di rotazione di 2.000-4.000 rpm per produrre un film di spessore 0,3-0,5 micron.
3. Reticolo la pellicola di fotoresist con le dimensioni corrette utilizzando un sistema di fotolitografia
4. Immergere completamente le fette di silicio photoresist rivestite con fantasia in un volume appropriato di soluzione photoresist in via di sviluppo.
5. Sciacquare i wafer di silicio photoresist rivestite sviluppati con acqua deionizzata.
6. Per formare array di sub-micron creste scala con pareti laterali verticali vicino, profondo reattiva etch ioni di silicio esposto utilizzando un sistema di incisione.
7. Rimuovere il fotoresist rimanente posizionando il wafer di silicio in un sistema asher plasma.
8. Tagliare il silicio wAfers con una fresa diamantata nei padroni di silicio opportunamente dimensionati per il successivo stampaggio replica.

2. Fabbricazione di PUA Stampo da Silicon Maestro

NOTA: Volume da aggiungere al padrone silicio per nanofabbricazione varierà a seconda della zona del master nanostrutturati da replicare e la viscosità della soluzione di poliuretano acrilato (PUA).

1. Pulire la superficie di silicio maestro con il 100% di etanolo o xilene e asciutto in O ₂ / N ₂ gas.
2. Posizionare lato silicio maestro modello in una capsula di Petri.
3. Per un maestro di silicio con 2 cm x 2 cm modello di superficie, pipetta 40 ml di PUA al modello di superficie.
4. Mettere un foglio di 4 cm x 4 cm trasparente in poliestere (PET) il PUA erogato.
5. Premere sul foglio PET e diffondere la PUA sotto il lenzuolo sulla faccia pattern usando un rullo o una superficie piana taglio (ad esempio una carta) in modo che l'interamodello è coperto dal prepolimero PUA.
6. Mettere maestro di silicio, prepolimero, e PET circa 10 cm sotto una luce 20 Watt (115 V) UV (λ = 365 nm) per 50 sec. Per essere efficace, la lunghezza d'onda della luce UV può essere ovunque tra 310-400 nm. L'intensità della luce è 10-15 mW / cm ² alla superficie del substrato.
7. Dopo l'indurimento, rimuovere i fogli di PET lentamente con una pinza. PUA deve allegare al film PET con un negativo del silicio maestro nanopattern.
8. Cure nanopatterns PUA / PET in UV per almeno 12 ore prima dell'uso. La sovraesposizione non è un problema.
9. Per pulire maestri silicio, posizionare un altro film di PET in cima al padrone senza l'aggiunta di PUA e esporre a luce UV (λ = 365 nm) per 50 sec e rimuovere i fogli di PET. Questo eliminerà eventuali monomeri che non hanno reagito.
10. Sciacquare maestro di silicio con il 100% di etanolo o xilene e secco sotto O ₂ / N ₂ gas.

3a. Polymer nanopatterning poliuretano

1. Preparare 25 mm di diametro vetrini circolari ponendo in un camera di trattamento ozono per 10 min.
2. Posizionare vetrini ozono trattati sul piccolo blocco PDMS per una facile movimentazione.
3. Applicare uno strato sottile di superficie promotore di adesione con pennello per vetrini. Vie vetrini asciugare per 30 min.
4. Posizionare il vetrino su un pezzo di carta per stampanti.
5. Goccia dispensare 10 ml di poliuretano (PU) pre-polimero (NOA 76) al centro di vetrino. Assicurarsi che non siano presenti bolle dopo l'aggiunta.
6. Muffa posto PUA, modello a faccia in giù, sul vetrino. Disperdere il PU uniforme su tutta la superficie del vetrino tirando un rullo di gomma cilindro lungo lo stampo PUA. Carta per stampanti in grado di assorbire troppo pieno polimero.
7. Lampada UV Watt. Tempo di polimerizzazione del PU dipende dalla potenza della sorgente UV.
8. Togliere il campione dal sorgente di luce UV e staccare con cura lo stampo PUA dal vetrino spalmato PU. Polimerizzazione del PU è considerato complete quando i PUA stampo bucce pulito di distanza dal campione e il vetrino PU ha un aspetto cangiante.
9. Posizionare campioni finiti in essiccatore per la conservazione a lungo di un mese.

3b. Nanopatterning Poli (Lactide-Co-Glycolide) Hydrogel

1. Creare uno stampo PDMS piatto vigorosamente mescolando silicone base di elastomero di silicone elastomero agente indurente in un rapporto di 10:1.
2. Pour PDMS misti precursore soluzione in una capsula di Petri in modo che il precursore PDMS raggiunge i 5 mm fino al bordo del piatto (cioè tale PDMS uno spessore di 5 mm).
3. Porre piastra di Petri e PDMS precursore in un essiccatore per 1 ora a Degas.
4. Spostare piastra di Petri e PDMS precursore in un forno a 65 ° C per almeno 2 ore per curare.
5. Dopo PDMS è guarito, utilizzare un rasoio per tagliare i PDMS piatto in 3 cm x 3 cm sezioni quadrate. Questi saranno i PDMS piatto stampi utilizzati in seguito nel processo di patterning.
6. Clean 25 mm di diametro vetrini circolare di placing in alcol isopropilico per 30 minuti in un sonicatore acqua.
7. Dry vetrini puliti in O ₂ / N ₂ gas.
8. Goccia dispensare 100 ul di soluzione di PLGA (15% w / v PLGA in cloroformio) sul vetrino.
9. Posizionare uno stampo PDMS piatta sulla parte superiore del PLGA erogato per assorbire il solvente e ottenere una superficie piana PLGA. Applicare una leggera pressione (~ 10 kPa) posizionando un peso di 200 g in cima alle PDMS per 5 min.
10. Sbucciare lentamente stampo PDMS piana e posizionare il vetro di copertura su un piatto preriscaldato (120 ° C) per 5 minuti per rimuovere il solvente residuo e aumentare l'adesione tra il PLGA e il vetro di copertura.
11. Collocare lo stampo NP PUA sopra il piatto PLGA e applicare una pressione costante (~ 100 kPa) e calore (120 ° C) posizionando un peso 1 kg sulla parte superiore dello stampo PUA mentre sulla piastra di riscaldamento per 15 min.
12. Rimuovere il peso dal PLGA coperchio scorrevole e lasciare il substrato raffreddare a temperatura ambiente. Non rimuovere PUA stampo fino a quando i substrati sono statiraffreddato.
13. Una volta che i substrati sono sufficientemente raffreddato, togliere via lo stampo NP PUA, rivelando il substrato NP PLGA. Il substrato NP PLGA dovrebbe avere un aspetto iridescente.
14. Posizionare campioni finiti in essiccatore per la conservazione a lungo di un mese.

4. Semina cellulare e cultura

NOTA: Questo protocollo descrive la cultura della neonatali miociti ventricolari di ratto (NRVMs) e cardiomiociti H7 umane staminali embrionali derivate da cellule (hESC-CMS), ma altre fonti di cellule possono essere utilizzati.

1. Applicare i coprioggetti ANF (PU o PLGA) di un tessuto di cultura piatto di polistirolo da 35 mm. Pipettare 20 ml di Norland Optical Adhesive (NOA83H) sul fondo del piatto e posizionare con cura il vetrino ANF sulla parte superiore del NOA. Lasciare che la colla per stendere e coprire tutto il fondo vetrino. Cure NOA esponendo piatto ai raggi UV per 10 min.
2. Sterilizzare ANF risciacquando con 2 ml di soluzione acquosa di etanolo al 70% per 5 minuti, due volte. Rimuovere ethanol per aspirazione. Lasciare ANF completamente asciugare all'aria per circa 1 ora sotto la lampada di sterilizzazione UV (λ = 200-290 nm) nella cappa di sicurezza biologica.
3. Adesione cellulare è arricchito da rivestimento della ANF in fibronectina durante la notte. Diluire fibronectina in acqua deionizzata a 5 mg / ml. Pipettare 2 ml di soluzione di fibronectina nel piatto. Porre in incubatore a 37 ° C e 5% CO ₂ durante la notte (almeno 6 ore).
4. Ottenere NRVMs, hESC-CMS o altre cellule cardiache di interesse in base alle precedenti protocolli ^22.
5. Campione di cellule centrifugare a 1000 rpm per 3 minuti per agglomerare le cellule.
6. Rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione. Assicurarsi di non disturbare il pellet.
7. Risospendere le cellule in opportuno terreno di coltura ad una concentrazione di 4,6 x 10 ⁶ cellule / ml.
8. Pipetta con cautela 200 ml di sospensione cellulare su ANF sterilizzati. Assicurarsi sospensione cellulare rimane sul vetrino.
9. Posizionare cellule in incubatore a 37 ° C e 5%CO ₂ per 4 ore per permettere alle cellule di allegare al ANF.
10. Aggiungere 2 ml di terreni di coltura caldo al piatto e sostituire le cellule in incubatrice alle stesse condizioni.
11. Dopo 24 ore, rimuovere il supporto e lavare con 2 ml di DPBS due volte per rimuovere le cellule in eccesso.
12. Aggiungere 2 ml di terreni di coltura caldo al piatto e sostituire le cellule in incubatrice alle stesse condizioni. Cultura le cellule a confluenza. Sostituire i media ogni altro giorno.

Results

La figura 1 è uno schema del processo di produzione per i due metodi di fabbricazione. A causa della diffrazione della luce causata dalla topografia nanoscala, nanopatterning dovrebbe risultare in una superficie iridescente alla ANF. Figura 2 mostra questa superficie iridescente su un ben modellata-25 millimetri coprioggetto NP-PU (Figura 2A) con cresta 800 nm e scanalatura larghezza (Figura 2B). L'aspetto iridescente della ANF varierà leggermente a sec...

Discussion

Tessuti cardiaci funzionalmente maturi sono carenti sia in vivo che in vitro applicazioni di ingegneria tissutale cardiaco. I metodi di nanofabbricazione CFL qui descritte sono tecniche robuste per realizzare l'allineamento cellulare e influenzare la funzione del tessuto macroscopico dovuto alla scalabilità del sistema. Grandi aree possono essere facilmente modellati e utilizzati per la coltura cellulare. Macroscopico allineamento cellulare è essenziale in ingegneria tessuto cardiaco per creare biomimetico,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectina	BD Biosciences	354008
NOA 76	Norland Products, Inc.	7606B
Promotore di adesione superficiale (primer per vetro)	Minuta Tech
PUA	Minuta Tech	MINS-311RM
Rullo in gomma morbida	Speedball
Wafer di silicone	NOVA Materiali elettronici	FA01-9900
Photoresist	Shipley	SPRT510
Photoresist Developer	Shipley	MF320
Sistema di litografia a fascio di elettroni	JEOL	JBX-9300FS
Sistema di incisione	di tecnologia di superficie	NP10 8UJ
Sistema di asher al plasma	BMR Technology Co.	DSF-200
Sistema di cura dell'ozono	Minuta Tech	MT-UV-O-08
Sistema di polimerizzazione per fusione	Minuta Tech	MT-UV-A 11
NOA 83H	Norland Products, Inc.	8301
Spin Coater Laurel	Technology	WS-400-6NPP
Skyrol PET Film	SKC Co., Ltd.	23038-59-9
Vetrini da 25 mm	Corning	2948
Sylgard 184 Kit di elastomeri siliconici	Dow Corning	6/5/2553
Poli (D,L-lattide-co-glicolide)	Sigma-Aldrich	P2191-1G
Cloroformio	Sigma-Aldrich	372978-1L
500 g Pesi	Global Insustrial	T9FB503120
Alcool isopropilico	EMD Millipore	PX1835-2
Piastra riscaldante	Corning	PC-420D
	Sonicatore Branson	B2510MTH