L'autofagia è un processo onnipresente che permette alle cellule di degradare e riciclare le proteine e organelli. Applichiamo la microscopia a fluorescenza avanzata per visualizzare e quantificare il piccolo, ma, cambiamenti fisici essenziali connessi con l'induzione di autofagia, tra cui la formazione e la distribuzione di autophagosomes e lisosomi, e la loro fusione in autolysosomes.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cancro della prostata è la forma principale di tumori maligni tra gli uomini negli Stati Uniti Mentre la chirurgia comporta un rischio significativo di impotenza e incontinenza, gli approcci tradizionali chemioterapici sono stati in gran parte senza successo. La terapia ormonale è efficace in fase iniziale, ma spesso non riesce con l'eventuale sviluppo di tumori ormone-refrattario. Siamo stati interessati a sviluppo di terapie mirate specifica carenza metabolica delle cellule tumorali. Recentemente abbiamo dimostrato che le cellule tumorali prostatiche specificamente privi di un enzima (sintasi argininosuccinate, o ASS) coinvolti nella sintesi dell'amminoacido arginina 1. Questa condizione fa sì che le cellule tumorali di diventare dipendente da arginina esogena, e subiscono lo stress metabolico quando arginina libera è esaurito da arginina deiminase (ADI) 1,10. Infatti, abbiamo dimostrato che le cellule del cancro alla prostata umano CWR22 RV1 sono effettivamente uccisi da ADI con apoptosi caspasi-indipendente e autopha aggressivogy (o macroautofagia) 1,2,3. L'autofagia è un processo evolutivamente conservato che permette alle cellule di metabolizzare le proteine indesiderate ripartizione lisosomiale durante il digiuno alimentare 4,5. Anche se i componenti essenziali di questo percorso sono ben caratterizzati 6,7,8,9, molti aspetti del meccanismo molecolare sono ancora poco chiari - in particolare, qual è il ruolo dell'autofagia nella morte-risposta delle cellule tumorali della prostata dopo il trattamento ADI ? Per far fronte a questa domanda, abbiamo richiesto un metodo sperimentale per misurare il livello e la portata della risposta autophagic nelle cellule - e poiché non ci sono marcatori molecolari noti che possono tracciare accuratamente questo processo, abbiamo scelto di sviluppare un approccio di imaging-based, utilizzando quantitativa 3D microscopia a fluorescenza 11,12.
Utilizzando CWR22Rv1 cellule specificamente marcati con sonde fluorescenti per autophagosomes e lisosomi, dimostriamo che gli stack di immagini 3D acquisiti sia con widefield deconvoluzione microscopia (e più tardi, con la super-risoluzione, microscopia strutturato-illuminazione) in grado di catturare in modo chiaro le prime fasi di induzione di autofagia. Con le applicazioni di analisi delle immagini digitali disponibili in commercio, possiamo facilmente ricavare informazioni statistiche sul numero autofagosoma e lisosomi, le dimensioni, la distribuzione, e il grado di colocalizzazione da qualsiasi cellula creata l'immagine. Questa informazione ci permette di tracciare con precisione i progressi di autofagia nelle cellule viventi e consente di continuare la nostra indagine sul ruolo dell'autofagia nella chemioterapia del cancro.
Protocollo
1. Parte 1: coltura cellulare ed Etichettatura Immuno-fluorescenza
- Crescere CWR22 RV1 cellule tumorali della prostata umana su vetro coprioggetto (# 1.5 o 170 micron di spessore) posti in piastre da 6 pozzetti, con RPMI (Mediatech, VA) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina / glutammina.
- Indurre l'autofagia trattando campioni selezionati con arginina deiminasi (ADI, 0.3 mg / ml) in tampone fosfato salino (PBS).
- Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (PFA, Fisher Scientific, NH) diluita in PBS; 100 microlitri per coprioggetto, per 10 min a RT.
- Lavare le cellule 3 vo....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La sequenza di immagini mostrato in Figura 1 mostra i cambiamenti fisici che si verificano in CWR22 cellule durante il primo 80 min dell'induzione autofagia. In questo ed altri studi (non mostrato) abbiamo costantemente osservato: (1) lo spostamento del nucleo di distanza dal centro della cella; (2) riduzione dei punti di adesione focale, e (3) traslocazione generale autophagosomes e lisosomi verso il centro del cella. Inoltre, abbiamo anche osservato un piccolo aumento della co-localizzazione (indi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Mentre l'osservazione diretta di cellule marcate con sonde fluorescenti contro LC3 è ampiamente accettata come un metodo standard per confermare la risposta autophagic 6, l'imaging 3D quantitativa dello stesso sistema (come abbiamo fatto) fornisce informazioni senza precedenti e di dettaglio circa il complesso processo di autofagia cellulare . In particolare, si osserva che centinaia (se non migliaia) di autophagosomes in cellule vive sono formate all'interno di 80 min di induzione di autofagia. A.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Concessione di aiuti: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0.120.999 Centro per Biofotonica Science & Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ grassetto), la ricerca Consiglio di Norvegia, Leiv Eiriksson viaggio di Grant 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung riconosce anche il sostegno della Auburn Comunità Cancer Fondo di dotazione. RJ Grassetto riconosce anche il sostegno della J. McDonald dotazione.
Ringraziamo il Dr. Jenny Wei-Jen Kung e il dottor Bor-Wen Wu a DesigneRx per la generosa offerta di ADI.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Arginina Deiminasi (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Caseina | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldeide | Fisher | 4042 | |
| Saponina | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-topo 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-coniglio 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Rosso DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Caderina | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm piastra inferiore in vetro rivestito in poli-d-lisina | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, vetrino coprioggetti da 22 mm | Corning | #2865-22 | |
| Vetrini per microscopio | Globe Scientific | 1324G |
Riferimenti
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
