Stiamo presentando un In vivo Saggio per testare vaso sanguigno permeabilità. Questo saggio è basato sulla iniezione endovenosa di un colorante e la successiva visualizzazione della sua diffusione negli spazi interstiziali.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo metodo si basa sulla iniezione endovenosa di Evans blu in topi come modello animale di prova. Blu di Evans è un colorante che si lega all'albumina. In condizioni fisiologiche l'endotelio è impermeabile all'albumina, in modo da Evans blu resti albumina legata restrizioni all'interno dei vasi sanguigni. In condizioni patologiche che promuovere un aumento della permeabilità delle cellule endoteliali vascolari parzialmente perdono i loro contatti stretti e l'endotelio diventa permeabile alle proteine di piccole dimensioni come l'albumina. Questa condizione consente per lo stravaso di Blu di Evans nei tessuti. Un endotelio sano impedisce stravaso del colorante nei tessuti circostanti vascolarizzati. Organi con aumento della permeabilità mostrerà significativamente aumentata colorazione blu rispetto a organi con endotelio intatto. Il livello di permeabilità vascolare può essere valutata mediante semplice visualizzazione o misurazione quantitativa del colorante incorporato per milligrammo di tessuto di controllo contro animale sperimentale / tessuto. Due PoweRFUL aspetti di questo test è la sua semplicità e le caratteristiche quantitative. Evans blu colorante può essere estratto dai tessuti incubando una quantità specifica di tessuto in formammide. Evans Blue è massima assorbanza a 620 nm e minimo assorbimento è a 740 nm. Utilizzando una curva standard per Evans blu, misure di densità ottica può essere convertito in colorante milligrammo catturato per milligrammo di tessuto. Analisi statistica dovrebbe essere utilizzato per valutare le differenze significative nella permeabilità vascolare.
Introduzione
Formazione e il mantenimento di barriere permeabili selettive sono essenziali per lo sviluppo di organi corretto e 1,2 prestazioni. Cellule endoteliali linea lume del vaso sanguigno e formano una barriera semipermeabile che è essenziale per il trasporto selettivo tra sangue e lo spazio interstiziale di tutti gli organi. Una barriera di permeabilità adeguata è mantenuta attraverso stretti cellula-cellula giunzioni che sono strettamente controllate da fattori di crescita, citochine e molecole correlate allo stress altri 3. Deterioramento della barriera endoteliale può causare aumentata permeabilità vascolare e perdite. Questi effetti sono visti in....
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Protocollo
1. Iniezione endovenosa di Evans Blue in the Vein laterale coda di topo
- Preparare una soluzione allo 0,5% sterile di blu di Evans in PBS. Se necessario, filtro sterilizzare la soluzione per rimuovere particelle che non è dissolto.
- Aspirare 200 ul Evans soluzione di blu in una siringa. Evitare tutte le bolle d'aria che possano esser sfuggite nella siringa.
- Luogo topi che sono 8-12 settimane di vita in un dispositivo di ritenuta in modo che l'animale non è liberamente mobile, ma la coda può essere gestito.
- Posizionare il dispositivo di ritenuta del mouse sul fianco con la vena caudale laterale è facilmente visibile e son....
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Risultati
Abbiamo utilizzato un saggio di permeabilità in vivo per verificare perdite nave in topi 8-12 settimane di vita. Questo test è utile per confrontare la relativa permeabilità vascolare tra animali di diverso background genetico o in un singolo ceppo di topi sottoposti a trattamenti che colpiscono il sistema vascolare. I nostri risultati mostrano che un ceppo di topi geneticamente modificati che abbiamo creato nel nostro laboratorio ha un endotelio più permeabile rispetto ai topi wild-type. Questi cambia.......
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Discussione
Permeabilità vascolare è un indicatore fondamentale per lo stato dei vasi sanguigni. Aumento della permeabilità vascolare ha dimostrato di essere presente in numerose malattie sistemiche, compreso il diabete, ipertensione e malattie autoimmuni 6,7,8. Aumento della permeabilità vascolare ha dimostrato di essere mediata da shear stress, fattori di crescita come il fattore di crescita vascolare endoteliale e fattore di crescita dei fibroblasti, mediatori infiammatori quali serotonina, istamina e bradichinina
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto o in competizione interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health, R01CA142928.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTE | |||
| EVANS BLU | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | Fosfato 0,2 M 1.5M NaCl pH 7,4 | ||
| ATTREZZATURE | |||
| SPETTROFOTOMETRO | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE dispositivo di sicurezza per | Harvard Apparatus | 340012 | |
| SIRINGA | BD | 309659 | |
| AGHI | BD | 305106 | Il calibro dell'ago dipende dalla taglia dell'animale. |
| SALDO | DENVER STRUMENTO | TP-64 |
Riferimenti
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. <....
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Ristampe e permessi
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