Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

Sommario

Descriviamo un metodo robusto per immunoprecipitazione della cromatina utilizzando cellule T primarie. Il metodo si basa su approcci standard, ma utilizza uno specifico insieme di condizioni e reagenti che migliorano l'efficienza per una limitata quantità di cellule. Importante, una descrizione dettagliata della fase di analisi dei dati è presentato.

Abstract

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un metodo ampiamente utilizzato per determinare le interazioni delle diverse proteine ​​con il DNA in cromatina delle cellule viventi. Gli esempi includono sequenza-specifici di DNA binding fattori di trascrizione, istoni ed i loro diversi stati di modifica, enzimi come la RNA polimerasi e fattori accessori e componenti di riparazione del DNA. Nonostante la sua ubiquità, vi è una mancanza di up-to-date, metodologie dettagliate per entrambi preparazione banco di materiale e per l'analisi accurata permettendo metriche quantitative di interazione. A causa di questa mancanza di informazioni, e anche perché, come ogni immunoprecipitazione, le condizioni devono essere ri-ottimizzato per una nuova serie di condizioni sperimentali, il saggio di ChIP è suscettibile di risultati inesatti o mal quantitativa.

Il nostro protocollo deriva in ultima analisi dal lavoro seminale sul fattore di trascrizione: interazioni DNA ^1,2, ma incorpora una serie di miglioramenti per sensibività e riproducibilità per difficili da ottenere i tipi di cellule. Il protocollo è stato usato con successo ^3,4, sia utilizzando qPCR per quantificare arricchimento DNA, oppure utilizzando una variante semi-quantitativa del sottostante protocollo.

Questa analisi quantitativa di materiale amplificato per PCR viene eseguita computazionalmente, e rappresenta un fattore limitante nel saggio. Controlli importanti e altre considerazioni includono l'uso di un anticorpo isotipo-abbinato, così come la valutazione di una regione di controllo del DNA genomico, come ad esempio una regione intergenica predetto di non essere vincolata dalla proteina in studio (o anticipato di non mostrare i cambiamenti in le condizioni sperimentali). Inoltre, una curva standard di materiali di input per ogni campione ChIP è usato per derivare i livelli assoluti di arricchimento nel materiale sperimentale. Utilizzo di curve standard aiuta a tenere conto delle differenze tra le serie di primer, indipendentemente da come sono progettati con cura, e anche l'efficienza differirerenze in tutto il range di concentrazioni modello per un singolo set primer. Il nostro protocollo è diverso dagli altri che sono disponibili in ^5-8 che coprono estensivamente la, fase successiva analisi.

Protocollo

1. Isolamento del mouse CD4 naïve splenica cellule T

1. Sacrifica il mouse in maniera umana coerente con Institutional Animal Care e utilizzo Comitato protocolli (IACUC). Sezionare la milza e posizionarlo nella capsula di Petri contenente 10 ml di DMEM con 10% FBS.
2. Schiacciare la milza con estremità glassati di due vetrini per liberare le splenociti. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml.
3. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg (~ 1.200 rpm per una centrifuga clinica con un diametro tipico rotore) per 5 min a 4 ° C.
4. Risospendere le cellule in 2 ml di tampone di lisi ACK globuli rossi, 1 min a tempera....

Risultati

L'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) protocollo presentato qui i controlli per le differenze, se del caso, nella quantità di DNA utilizzati in PCR mediante l'utilizzo di una coppia di primer che amplifica una regione legata di genoma, quindi servire come un "controllo del carico". Nell'esempio illustrato nella figura 3, abbiamo utilizzato la regione codificante del gene ACTB topo come una regione non legato alla nostra proteina di interesse e del sito di legame NF.......

Discussione

Il protocollo di cui sopra fornisce un metodo robusto di quantificare con precisione l'arricchimento del DNA da linfociti primari che utilizzano chip. Un importante motivo per la robustezza in questo protocollo è l'inserimento di biologico replica. Il protocollo precedente utilizza tre repliche, l'arricchimento per il quale viene calcolato in modo indipendente. Le uscite vengono quindi mediati per fornire un grado di arricchimento e deviazioni standard calcolate per fornire una misura della variabilità. Per .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Formaldeide	Sigma	F-8775	Negozio presso RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Negozio a 4 ° C
Compresse inibitore della proteasi	Roche	04693116001	Conservare a 4 gradi C
Protein G perline magnetiche	Motivo attivo	101945	Conservare a 4 gradi C
RNasi A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Conservare a -20 ° C
Proteinasi K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Sciogliere in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platino Taq DNA polimerasi	Invitrogen	10966-034	Conservare a -20 ° C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Negozio a -20 C
1 M Glicina			Conservare presso RT
Tampone di lisi cellulare (5 mM di tubi, pH 8,0; 85 mM KCl; 0,5% NP-40)			Conservare a 4 gradi C
Tampone di lisi nucleare (50 mM Tris, pH 8,1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Conservare a tampone di
diluizione RT ChIP (0,01% SDS; 1,1% Triton X-100; 1,2 mM EDTA; 16,7 mM Tris pH 8,1; 190 mM NaCl)			Conservare a 4 gradi; C
Tampone di lavaggio a basso contenuto di sale (0,1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8,1; 150 mM NaCl)			Conservare a 4 gradi; C
Tampone di lavaggio ad alto contenuto salino (0,1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8,1; 600 mM NaCl)			Conservare a 4 gradi; C
LiCl tampone di lavaggio (0,25 M LiCl; 1% NP-40; 1% desossicolato di sodio, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8,0)			Conservare a 4 gradi
C tampone TE (10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA)			Conservare a 4 °C; C
Tampone di eluizione (1% SDS; 0,1 M NaHCO3)			Preparare un
NaCl			Conservare presso RT
0,5 M EDTA			Conservare presso RT
1 M Tris-HCl, pH 6,5			Conservare presso RT
Tabella dei reagenti specifici
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Modello: 421105
Supporto magnetico	Promega	Z5342
Kit di purificazione PCR Qiaquick	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Modello: Spettrofotometro UV S3000
	NanoDrop Technologies	ND-1000
Blocco riscaldante	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Centrifuga refrigerata da banco	Beckman Coulter	Modello: Allegra X-12R
Microcentrifuga	Eppendorf	5415 D
Tabella delle apparecchiature

fresco 5 M