Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero

Sommario

Qui si descrive un metodo per visualizzare reticolo endoplasmatico associate mRNA in cellule di mammifero coltura tissutale. Questa tecnica comporta la permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica con digitonina di rimuovere contenuto citoplasmatico seguite da fluorescente In situ per rilevare sia bulk poly (A) o mRNA trascritti specifici.

Abstract

Negli eucarioti, la maggior parte degli RNA messaggeri (mRNA) che codificano proteine ​​di membrana e secrete sono localizzati sulla superficie del reticolo endoplasmatico (ER). Tuttavia, la visualizzazione di questi mRNA può essere difficile. Ciò è particolarmente vero quando solo una frazione del mRNA è ER-associata e la loro distribuzione per questo organello è ostruita da non bersaglio (cioè "libero") trascritti. Per monitorare ER-mRNA associati, abbiamo sviluppato un metodo in cui le cellule vengono trattate con una breve esposizione ad una soluzione di estrazione digitonina che permeabilizes selettivamente la membrana plasmatica, e quindi rimuove i contenuti citoplasmatici, mantenendo al tempo stesso l'integrità del ER . Quando questo metodo viene accoppiato con ibridazione in situ fluorescente (FISH), si può chiaramente visualizzare ER-mRNA legati al microscopio a fluorescenza. Usando questo protocollo il grado di ER-associazione sia per sfusi poli (A) o trascritti specifici mRNA può essere valutatae anche quantificato. Nel processo, si può usare questo test per indagare la natura delle interazioni ER-mRNA.

Introduzione

Negli eucarioti, la codifica mRNA secreta e proteine ​​di membrana possono essere mirati al pronto soccorso co-traduzionale dal ^1,2 particella di riconoscimento del segnale e possono essere mantenuti al pronto soccorso tramite le interazioni dirette tra ribosomi e translocons durante la traduzione ^3,4. Tuttavia, se mRNA può essere mirata e mantenuto sul indipendente di ER sia ribosomi o traduzioni non era chiaro fino a poco tempo fa. Studi precedenti ha tentato di affrontare l'esistenza di traduzione-associazione indipendente mRNA con l'ER con tecniche di frazionamento cellulare. Poiché le condizioni chimici aggressivi sono stati tenuti a dissociarsi da ribosomi ER vescicole derivate, che possono influenzare negativamente il delicato potenzialmente mRNA-ER associazione, questi studi sono stati inconcludenti, fornendo prove per ^5-8 e contro ^9,10 ribosomiale-fissaggio indipendente di mRNA al pronto soccorso .

Per aggirare questi problemi, abbiamo sviluppato un prototipocol di isolare e di immagine ER-bound mRNA. Questa procedura comporta un blando trattamento di estrazione, che rimuove efficacemente tutto il contenuto citoplasmatico della cellula (anche non ER-bound mRNA) preservando al tempo stesso la morfologia ER e tutte le sue molecole associate. Usando questo protocollo abbiamo dimostrato che un sottoinsieme di mRNA sono mirati e poi mantenuto sul ER indipendentemente ribosomi o traduzione ^11.

Protocollo

1. Preparazione dei materiali per l'estrazione

1. Preparazione delle cellule
   1. Seed coltura cellule del tessuto su vetrini trattati con acido per almeno un giorno prima dell'esperimento. Usiamo COS-7 o U2OS, come queste due linee cellulari esporre robusta produzione di proteina secreta e hanno un ben definito ER. Si noti che per ottenere elevata efficienza di estrazione, le cellule non deve superare il 80% di confluenza in coprioggetto il giorno dell'esperimento.
   2. Se un mRNA particolare esogeno è indagato, le cellule vengono trasfettate un giorno dopo la semina con plasmidi contenenti il ​​gene di interesse utilizzando i protocolli di trasfezione standard. Le cellule sono poi consentito di esprimere l'mRNA per almeno 18 ore prima dell'estrazione.
2. Trattando le cellule con inibitori di traduzione
   1. Per verificare l'effetto di ribosomi intatti sul mantenimento di mRNA associazione con l'ER, le cellule possono essere trattati con gli inibitori di traduzione che inficiano l'associazionedei ribosomi con l'mRNA ^11.
   2. Inibitori di inizio della traduzione, come homoharringtonin (HHT), pactamycin, o 2 - (4-metil-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (mdmp), impediscono ribosomi nuovi di associarsi trascrizione consentendo allo stesso tempo ribosomi impegnati a completare traduzione ^12-14. Poiché il tasso di traduzione per la maggior parte delle proteine ​​in cellule di mammifero è 5 aminoacidi al secondo, indipendentemente dalla lunghezza o codoni dell'mRNA ^15, un trattamento di 30 minuti dovrebbe cancellare ribosomi off di messaggi con cornici di lettura aperte fintanto 27.000 (nucleotidi che codifica per proteine purché 9000 amminoacidi).
   3. Inibitori come la puromicina promuovere l'espulsione prematura della catena nascente e quindi interrompere polisomi ^12. Tuttavia per interrompere completamente l'associazione dei ribosomi puromicina-trattati con l'mRNA, magnesio chelanti come EDTA deve essere aggiunto al tampone di estrazione digitonina ^11.
   4. In questo esperimento, le cellule vengono trattate con 200 pM puromicina, HHT 5 pM, o mezzo di controllo per 30 minuti prima dell'estrazione.
3. Preparazione del tampone di estrazione Digitonin. Per visualizzare ER-localizzate mRNA senza l'ostruzione di liberi (citoplasmatici, non-ER-associate) trascritti, abbiamo selettivamente permeabilize la cella con digitonina, un glicoside steroide che interagisce preferenzialmente con 3β-hydroxysterols. A basse concentrazioni, digitonina permeabilizes selettivamente porzioni della membrana plasmatica, causando 'leakiness' ^16. In contrasto, la membrana ER e involucro nucleare, che sono poveri in colesterolo, vengono lasciati intatti ^16,17.
   1. Digitonina (Sigma Aldrich) in polvere viene disciolto in acqua distillata a 5% peso / volume e questa soluzione viene frazionato in piccole quantità e conservati a -20 ° C. Nella nostra esperienza, di congelamento-scongelamento riduce l'efficienza della digitonina disciolto.
   2. Una soluzione stock di10x tampone CHO (1x concentrazione di soluzione di lavoro: 115 mm KAC, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM MgCl _2, 2 mM EGTA e saccarosio 150 mM) viene preparato con RNase-free reagenti e conservati a -20 ° C. Una soluzione di lavoro (1x tampone CHO) viene preparata diluendo la soluzione madre con acqua priva di RNasi e può essere conservato a 4 ° C.

2. Digitonin Estrazione

1. Preparazione di soluzioni d'estrazione
   1. Un blocco di riscaldamento con una superficie piana è pre-riscaldata a 40 ° C e mantenuta a questa temperatura durante l'estrazione.
   2. Per formare una superficie piana di lavoro che è RNasi libero, il blocco riscaldante viene inumidita con acqua e ricoperto con un nuovo pezzo di parafilm M (Società Bemis, Inc). Le bolle d'aria tra il foglio di parafilm e il blocco riscaldamento sono appianate con RNase-free guanti e Kimwipes (VWR).
   3. CHO 1x tampone viene riscaldato a 37 ° C mediante incubazione in un bagno d'acqua.
   4. Piastre da 6 pozzetti sono usati per lavaree fissare le cellule. Ciascuna fila di tre pozzetti viene utilizzato per una copertura antiscivolo. Per i primi due pozzi nella riga, 2 ml di tampone riscaldata CHO viene aggiunto. Per l'ultimo pozzetto, 2 ml di soluzione di fissazione (paraformaldeide PBS + 4% (Sciences Electron Microscope)) è aggiunto. Questo vassoio può essere memorizzato nella incubatore 37 ° C finché le cellule sono pronte per l'estrazione.
   5. Soluzione di estrazione digitonina viene preparata diluendo la soluzione digitonina magazzino a 0,025% con tampone caldo CHO appena prima dell'uso. Anche in questo caso notare che per puromicina cellule trattate, il tampone di estrazione deve inoltre contenere 20 mM EDTA per interrompere in modo efficiente ribosomi ^11. Gocce di 100 ml di soluzione di estrazione sono immessi sul parafilm coperto di blocco di riscaldamento immediatamente prima dell'estrazione.
2. Digitonin estrazione e fissazione delle cellule
   1. Rimuovere le cellule dal 37 ° C incubatore.
   2. Durante il processo di estrazione, coprioggetti sono manipolati con l'aiuto di pinze di jewler. Conla pinza prendere il vetrino ed immergerlo nel buffer prima e poi il secondo pozzetto contenente CHO per lavare del mezzo di crescita.
   3. Rapidamente asciugare il tampone in eccesso dal lato posteriore del vetrino con una Kimwipe e collocare immediatamente l', lato cella coprioggetto rivolto verso il basso, la soluzione di estrazione.
   4. Dopo 10 secondi, sollevare il vetrino con la pinza e subito il trasferimento, lato cellulare rivolto verso l'alto, al pozzo contenente il tampone paraformaldeide 4% di fissaggio.
   5. Lasciate che il incubare campione in fissativo per almeno 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Preparazione delle cellule di controllo non estratto. Per determinare la quantità totale di mRNA nel citoplasma, è una buona idea per preparare un campione di controllo non estratto.
   1. Le cellule cresciute su vetrini vengono preparati come sopra (vedi sezione 2.2), salvo che la fase di estrazione digitonina (2.2.3) viene saltato.
   2. Dopo la fissazione, i non-estratti celle devono essere permeabilizzate in PBS + 0,1% TritonX-100 per 15 minuti a temperatura ambiente.

3. FISH colorazione

1. Progettazione di sonde per ibridazione in situ fluorescente
   1. La sequenza primaria del mRNA di interesse è piegato utilizzando RNA secondaria software previsione della struttura, come RNAstructure 5,0 ^18. Le pieghe mRNA sono valutati visivamente per identificare una regione di circa 50 nucleotidi che è libero di grandi strutture secondarie.
   2. Il complemento inverso di questa regione viene sintetizzato con un fluoroforo Alexa546 attaccato alla estremità 5 'della sonda (acquistato da Integrated DNA Technologies).
   3. La sonda viene diluito con acqua priva di RNasi ad una concentrazione stock di 100 mM, che può essere conservato a -20 ° C.
2. La colorazione con sonde FISH
   1. Si noti che sebbene i digitonina-estratto cellule non richiedono ulteriore permeabilizzazione, trattamento di questi campioni fissati con 2 ml di 0,1% Triton X-100 diluito inPBS per 15 minuti a temperatura ambiente prima della colorazione FISH, contribuisce a ridurre il segnale di fondo.
   2. I vetrini vengono quindi lavati due volte con PBS per rimuovere qualsiasi residuo di paraformaldeide o Triton X-100.
   3. Le cellule vengono lavate due volte con il 25% al ​​60% formammide in 1X tampone sodio citrato (150 mM NaCl e 15 mM di citrato di sodio). Generalmente, per sonde FISH specifici che sono 50-60 nucleotidi in lunghezza, 60% formammide viene utilizzato, ma per poly (A) dell'mRNA colorazione con oligo (dT) sonda FISH, il livello di formammide viene ridotta fino al 25%.
   4. Per preparare la camera di colorazione, il fondo di un piatto Petri mm 150 è coperta con acqua e un pezzo di parafilm è fatto galleggiare sull'acqua. L'acqua viene rimossa ruotando il piatto sopra, permettendo così l'parafilm di aderire al fondo del piatto. Le bolle d'aria vengono rimossi manualmente con Kimwipes.
   5. Per ogni coprioggetto da colorare, pipettare una goccia 100 ml di soluzione di ibridazione contenente sonda FISH di interesse sulla parafilm nella camera di colorazione. La sonda FISH magazzino viene diluito con 25% al ​​60% formammide in tampone di ibridazione (1x SSC, 100 mg / ml di solfato di destrano, 1 mg / ml di lievito tRNA, 5mM complesso riboside vanadile, 25-60% formammide) ad una concentrazione operativa di 0,2 pM. Si noti che la quantità di formammide deve essere ottimizzato per la particolare sonda utilizzata ed è presente alla stessa concentrazione nel tampone SSC lavaggio (vedere fase 3.3.3).
   6. Il vetrino viene posizionato faccia laterale cella giù sulla soluzione FISH nella camera di colorazione e incubate per 5-24 ore a 37 ° C in una camera umidificata come la coltura tissutale incubatore.
3. Lavaggio e montaggio dei campioni colorati
   1. Per preparare una zona priva di RNasi di lavaggio, di prevedere una striscia di parafilm su una superficie piana, come un banco di laboratorio. Per garantire che il parafilm è piatto, bagnare la superficie piana, inserire il parafilm sulla parte superiore e rimuovere manualmente eventuali bolle d'aria con Kimwipes.
   2. La camera di colorazione èrimosso dal termostato e posto su una superficie piana. I vetrini vengono poi emessi da pipettando circa 500 ml di tampone di lavaggio FISH in prossimità del bordo di ogni coprioggetto. La soluzione sarà disegnato in-tra il vetrino e il parafilm tramite azione capillare.
   3. Per ogni coprioggetto, 1 ml di tampone di lavaggio (1x SCC con il 25-60% formammide, vedere il punto 3.3.3) è pipettati sul parafilm zona lavaggio (vedi punto 3.4.1).
   4. Utilizzando pinze, i coprioggetti sono rimossi dalla camera di colorazione e ciascuno è posto sulla goccia di tampone di lavaggio e incubate a temperatura ambiente per 5 min. Il processo di lavaggio viene ripetuta 3 volte.
   5. Vetrini vengono lavati con 70% etanolo ed essiccato con Kimwipes.
   6. Per ogni coprioggetto, 25 ml di soluzione di montaggio (DAPI Fluoromount G, Sud Biotech) viene pipettato nella diapositiva. Si noti che questa soluzione contiene 4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI), che DNA macchie e permette la visualizzazione dei nuclei.
   7. Usipinza ng e Kimwipes, la parte posteriore del vetrino viene asciugato e l'eccesso di tampone di lavaggio FISH è cancellato senza di essiccazione del campione. Ciascun vetrino viene quindi posto lato cella rivolto verso il basso, sulla goccia di soluzione di montaggio.
   8. I campioni vengono poi montati etichettati e possono essere conservare a 4 ° C.

4. Imaging e quantificazione

1. Imaging
   1. Un microscopio a epifluorescenza è utilizzato per l'immagine delle cellule seguenti colorazione FISH. La cellula transfettata può essere differenziata da cellule non trasfettate dalla brillante segnale di fluorescenza nel canale appropriato. Idealmente, ogni campo acquisito conterrà anche una cella non trasfettate essere utilizzato per determinare la fluorescenza di base per la quantificazione.
   2. Per ogni campo, le immagini della FISH e DAPI canale vengono acquisiti. Inoltre, se le cellule sono co-colorati con marcatori proteici, un'immagine del canale immunofluorescenza è anche acquistato. Si noti che l'estrazione digitonina può anche essere usatoper visualizzare ER-bound ribosomi e proteine ^​​11.
   3. Per garantire che le intensità di fluorescenza tra campi possono essere confrontati, il tempo di esposizione per ogni canale deve rimanere costante per ciascun set di esperimenti.
   4. Anche in questo caso per garantire che le intensità di fluorescenza tra le cellule su vetrini diversi possono essere confrontati, il giorno per giorno i cambiamenti di intensità epiluminescenza o decadimento del segnale FISH devono essere minimizzate, immagini di tutti i vetrini in una sola seduta.
2. Quantificazione. Per quantificare la quantità di mRNA che è localizzato sulla ER, usiamo Nikon software NIS Element. Tuttavia altri software di analisi di immagine come ImageJ può essere utilizzato.
   1. Utilizzando lo strumento di analisi ELEMENT Nikon NIS immagine, la periferia e il nucleo delle cellule sono descritte come Regione separato di interesse (ROI).
   2. Per ogni ROI, l'intensità fluorescente (I _T per l'intensità totale di cellule e _N per laintensità nucleare) e l'area (A _T e A _N) vengono registrati e esportati in un foglio elettronico di Excel.
   3. Per ogni immagine, l'intensità sfondo fluorescente (I _B) viene determinato registrando l'intensità di una cella non transfettate. Se poly (A) I livelli di mRNA sono stati analizzati, una cellula-libera è selezionato.
   4. La quantità totale di ER (in cellule estratte) o citoplasmatica (in cellule decompressi) fluorescenza viene calcolata mediante la formula:
      [A _T] [I _T - I _B] - _[AN] [I _N - I _B]
   5. L'intensità della colorazione nucleare possono essere calcolate e utilizzate come controllo interno fra i vari trattamenti. Poiché nuclei non sono influenzati dal trattamento digitonina ¹⁷ o interruzione ribosoma ^11, la quantità di mRNA nucleare deve rimanere costante tra ciascuno di questi trattamenti. Per calcolare fluorescenza nucleare viene utilizzata la seguente formula:
      _[AN] [I _N - IB]
   6. La percentuale di mRNA citoplasmatico che è ER-mirata può essere calcolato prendendo la fluorescenza media ER di 30-40 cellule estratte (vedere 4.2.4) diviso per la fluorescenza media citoplasmatica 30-40 cellule decompressi (di nuovo vedere 4.2.4) . È fondamentale che le cellule estratte e non estratto sono preparati, colorati e ripreso in parallelo.

Risultati

Per determinare la percentuale di mRNA che è ER-associata, cellule COS-7 che sono state trasfettate con plasmidi che contenevano la fosfatasi alcalina placentare (ALPP) o citocromo P450-8b1 (CYP8B1) sono state estratte con digitonina e poi fissato, o direttamente fissato (vedi Figura 1, confrontare "non estratto Ctrl" a "estratto Ctrl"). Il non nucleare fluorescenza è stata quantificata in entrambi i campioni e la frazione di ER-associata mRNA è stato calcolato (Figura 2).

Discussione

La localizzazione di mRNA per vari siti subcellulari, attraverso l'interazione con proteine ​​di trascritti di mRNA di localizzazione, è un fenomeno diffuso importante per il corretto smistamento delle proteine ​​alla loro destinazione finale, e per la messa a punto di espressione genica ai requisiti locali di un subcellulare regione ^19,20.

Utilizzando il test qui descritto, abbiamo rivisitato la questione se mRNA che codificano proteine ​​secretorie può essere mantenuto sul E...