Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Elad Noy; Maor H. Pauker; Mira Barda-Saad

doi:10.3791/50076

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Articolo metodologico

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

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DOI:

10.3791/50076

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23 giugno 2013

Elad Noy^*¹ , Maor H. Pauker^*¹ , Mira Barda-Saad¹

¹The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Si descrive un metodo live-cell imaging che permette di comprendere dinamica della proteina durante il processo di attivazione delle cellule T. Dimostriamo l'utilizzo combinato della cellula T diffusione saggio, microscopia confocale e analisi di imaging per produrre risultati quantitativi di seguire segnalamento formazione di complessi durante l'attivazione delle cellule T.

Abstract

Protezione contro le malattie infettive è mediato dal sistema immunitario ^1,2. Linfociti T sono coordinatori del master del sistema immunitario, regolando l'attivazione e risposte di molteplici cellule immunitarie ^3,4. Attivazione delle cellule T dipende dal riconoscimento di antigeni specifici mostrata dalle cellule presentanti l'antigene (APC). Il recettore dell'antigene delle cellule T (TCR) è specifico per ogni clone di cellule T e determina specificità antigenica ^5. Il legame del TCR all'antigene induce la fosforilazione di componenti del complesso TCR. Al fine di promuovere l'attivazione delle cellule T, questo segnale deve essere trasdotte dalla membrana al citoplasma e il nucleo, avviando varie risposte cruciali quali l'assunzione di proteine di segnalazione al TCR; sito APC (sinapsi immune), la loro attivazione molecolare, riarrangiamento del citoscheletro, elevazione della concentrazione intracellulare di calcio, e cambiamenti nell'espressione genica ^6,7. La corretta initiation e la cessazione dei segnali di attivazione è di fondamentale importanza per le risposte delle cellule T del caso. L'attività delle proteine di segnalazione dipende la formazione e la terminazione di interazioni proteina-proteina, post traduzionali come fosforilazione proteica, formazione di complessi proteici, ubiquitinazione proteica e l'assunzione di proteine a vari siti cellulari ^8. Comprendere il funzionamento interno del processo di attivazione delle cellule T è fondamentale sia per la ricerca immunologica e applicazioni cliniche.

Vari test sono stati sviluppati al fine di indagare le interazioni proteina-proteina, tuttavia, saggi biochimici, come ad esempio il metodo di co-immunoprecipitazione ampiamente utilizzato, non consentono posizione proteina di essere discerne, precludendo così l'osservazione di preziose informazioni sulla dinamica del cellulare meccanismi. Inoltre, questi test di massa di solito si combinano proteine da molte cellule diverse che potrebbero essere in diverse fasi di tindagò processo cellulare. Questo può avere un effetto negativo sulla risoluzione temporale. L'uso di immagini in tempo reale delle cellule vive permette sia il tracking spaziale delle proteine e la capacità di distinguere temporalmente tra eventi di segnalazione, che perde così in luce la dinamica del processo di ^9,10. Presentiamo un metodo di imaging in tempo reale della formazione di segnalazione-complesso durante l'attivazione delle cellule T. T-cellule primarie o linee di cellule T, come Jurkat, vengono trasfettate con plasmidi codificanti per proteine di interesse fuse ad proteine fluorescenti monomeriche, impedendo oligomerizzazione non fisiologico ^11. Diretta cellule T sono sceso sopra un coprioggetto pre-rivestite con cellule T attivante ^8,9 anticorpo, che si lega al complesso CD3/TCR, indurre l'attivazione delle cellule T superando la necessità di antigeni attivatori specifici. Cellule attivate sono costantemente ripreso con l'uso della microscopia confocale. Dati di imaging vengono analizzati per produrre risultati quantitativi, quali il collecoefficiente ocalization delle proteine di segnalazione.

Protocollo

1. Trasfezione di cellule T

Preparare la soluzione Nucleofector Amaxa attivato mescolando soluzione "Supplemento" del kit per la soluzione Nucleofector. La soluzione attivata può essere conservato a 4 ° C per tre mesi.
Coltivare le cellule Jurkat in mezzo di coltura [10% siero fetale di vitello (FCS), soluzione di penicillina-streptomicina 1%, e 2 mM L-glutammina in RPMI]. In modo ottimale, le cellule devono essere utilizzati 1-2 settimane dopo lo scongelamento. Utilizzando colture di cellule in crescita logaritmica è cruciale per alta efficienza di trasfezione e la sopravvivenza cellulare. Alternativamente, con piccole modifiche, questo protocollo può essere utilizzato con cellule T primarie, come descritto precedentemente ^8. Va sottolineato che la durata del processo di attivazione delle cellule T primarie è più lunga di quella delle cellule T Jurkat (~ 30 min), una fase di microscopio montato sistema di incubazione deve essere utilizzato per mantenere livelli di umidità e temperatura durante la CO _2, processo di attivazione.
Raccogliere 5Cellule × 10 ⁶ log-fase T per trasfezione in una provetta da 15 ml.
Centrifugare le cellule per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente.
Durante la centrifugazione, preparare una piastra da 6 pozzetti. Riempire una cavità per ogni trasfezione con 5 ml di terreno di coltura, e pre-incubare a 37 ° C.
Raccogliere le provette dalla centrifuga e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di RPMI.
Centrifugare le cellule per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente.
Durante la centrifugazione, preparare la soluzione di trasfezione. In un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, mescolare attivato 100 microlitri soluzione Nucleofector Amaxa preparata nel passaggio 1 con 5 pg di DNA del plasmide di interesse codificante una proteina fluorescente tag. In modo ottimale, la concentrazione di DNA dovrebbe essere maggiore di 1 pg / ml al fine di evitare di diluire la soluzione di trasfezione.
Mescolare bene pipettando dolce.
Dopo centrifugazione delle cellule, rimuovere con attenzione tutto il surnatante mentre non disturbing il pellet.
Pipettare la soluzione di DNA / trasfezione due volte.
Aggiungere la soluzione di DNA / trasfezione al pellet.
Trasferire le cellule alla Amaxa cuvetta.
Inserire la cuvetta nel dispositivo Amaxa Nucleofector.
Utilizzare l'impostazione H-10 Amaxa trasfezione per elettroporazione (per Jurkat) o T-23 (per le cellule T primarie).
Rimuovere la piastra da 6 pozzetti dall'incubatore.
Seguendo elettroporazione, trasferire accuratamente il surnatante con la sospensione cellulare alla piastra da 6 pozzetti con una pipetta Pasteur. Un pellet costituita da detriti cellulari può formare. Evitare di trasferire il pellet.
Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C.
Trasferire 2,5 ml di sospensione cellulare da ciascun pozzetto in un nuovo pozzo. Aggiungere 2,5 ml di terreno di coltura caldo (descritto nel passaggio 2) a ciascun pozzetto.
Dopo 72 ore, trasferire le cellule in una provetta sterile e centrifugare per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e sostituirlo wicultura th mezzo supplementato con la cellula di mammifero selezione antibiotica appropriata per il plasmide usato (applicare una concentrazione adatta per gli antibiotici utilizzati; abbiamo usato G418 e / o Hygromycin in concentrazioni di 1,3 mg / ml e / o 0,2 mg / ml, rispettivamente). Coltura la sospensione cellulare in un pozzo fresco. In alternativa, le cellule possono essere trasfettate transitoriamente e ripreso 48 ore dopo la trasfezione. Per preparare le cellule trasfettate transitoriamente, co-trasfezione delle cellule con i due plasmidi contemporaneamente al passaggio 8, continuando normalmente al punto 20, e quindi passare direttamente al punto 23. Si noti che in questo scenario, le cellule devono essere utilizzati immediatamente, e in generale la loro intensità di fluorescenza è eterogeneo e non necessariamente elevato.
Crescere le cellule con terreno di coltura addizionato con l'appropriato antibiotico selezione. Dividere le celle e di integrarle con terreno di coltura antibiotico-integrata, se necessario.
Dopo 2 settimane, verificare trasfezione successo con l'impiego di FACS (influenzacell sorting orescence-attivato) come segue:
Raccogliere 10 ⁶ cellule trasfettate, 10 ⁶ cellule trasfettate fittizi (controllo negativo), e 10 ⁶ cellule che sono noti per esprimere stabilmente la proteina fluorescente tag. Se le cellule vengono trasfettate con più di una proteina fluorescente (vedi passo 27), utilizzare più linee cellulari, singolarmente contrassegnati come controlli positivi.
Centrifugare le cellule per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente.
Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 microlitri tampone FACS (PBS w / o Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +,} 5% FCS, 0,05% sodio azide).
Utilizzare un FACS analisi per verificare la fluorescenza cellulare. Confrontare fluorescenza delle cellule trasfettate a quella dei controlli negativi e positivi.
Trasfezione le cellule con un ulteriore, fluorescente con tag proteine, ripetere i passaggi 3-26 utilizzando le cellule transfettate.
Cellule che mostrano alti livelli di fluorescenza dovrebbero essere utilizzati. In modo ottimale, almeno il 50% deile cellule nella coltura dovrebbero essere altamente fluorescente. Cella di fluorescenza può essere aumentato di ordinamento delle cellule tramite FACS.

Eventuali proteine marcate aggiuntivi devono essere fusi a differenti fluorofori ed essere codificati su plasmidi codificanti per diversi antibiotici di selezione. Mezzo di selezione per le cellule trasfettate con più di un plasmide dovrebbe essere integrato con tutti gli antibiotici appropriati.

2. Cellule T Diffondere Assay Preparazione

Utilizza Lab-Tek II tedesca sistema coverglass 4 diapositive da camera. Assicurarsi di non graffiare accidentalmente la superficie interna delle camere, ad esempio con una punta della pipetta, durante la preparazione o l'uso.
Preparare 50 ml di soluzione di preparazione del vetrino: prendere 4,6 ml di 12 M (37%), HCl, aggiungere 38,5 ml di etanolo al 100%, e 6,9 ml di acqua bidistillata.
Riempire ogni camera del vetrino con 500 microlitri soluzione preparazione del vetrino.
Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
Aspirare la cameras, li asciugare completamente.
Incubare i vetrini scoperto per 1 ora a 45 ° C fino a completamente asciutto.
Preparare 0,01% soluzione di poli-L-lisina diluendo 0,1% di poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) in acqua bidistillata.
Applicare 500 microlitri di ciascuna camera.
Incubare il vetrino per 15 min a temperatura ambiente.
Aspirare le camere, li asciugare completamente.
Incubare per 3 ore a 45 ° C fino a completamente asciutto.
Vetrini rivestiti possono essere conservati a secco per parecchi mesi a temperatura ambiente.
Preparare una soluzione di anticorpi attivazione. Utilizzare un anticorpo anti-CD3: o HIT3a (BD Pharmingen, # 555.337) o UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 mg / ml in 400 microlitri di PBS, per ogni camera. Questa soluzione deve essere preparata poco prima della preparazione del vetrino.
Riempire ogni camera con 400 microlitri della soluzione di anticorpi attivazione.
Incubare il vetrino per 2 ore a 37 ° C o, preferibilmente, una notte a 4 ° C.
Rimuovere l'attivazione di anticorpi solution e lavare immediatamente la camera due volte con 300 microlitri di PBS. Da questo punto, assicurarsi che le camere rimangono pieni di buffer.
Conservare il vetrino PBS-riempita a 4 ° C. Ti consigliamo di utilizzare le camere di diapositive preparate entro 1 settimana.

3. L'attivazione delle cellule T e Imaging

Preparare tampone di imaging [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml di FCS, 38,75 ml RPMI senza rosso fenolo]. Tampone di immagini può essere conservato a 4 ° C dopo filtrazione.
Attivare la Zeiss LSM 510 Meta microscopio. Scaldare il telaio di montaggio riscaldabile microscopio a 37 ° C. Selezionare "Expert Mode".
Fare clic sulla scheda "Acquisisci" e aprire le seguenti schede: Laser, Microscopia, configurazione, scansione, Time Series.
Attivare i laser necessari. Per l'eccitazione di MCFP e PFP, impostare l'Argon / 2 del laser di "stand-by" per 5 minuti, poi su "on".
Se avete eseguito questo test live-cell imaging prima, con gli stessi fluorofori, aprire il file LSM visualizzata fare clic sul "riuso" icon, e continuare dal punto 9. In caso contrario, continuare dal passaggio 6.
Definire i canali utilizzando filtri appropriati per l'eccitazione ed emissione delle proteine fluorescenti utilizzate.
Nella finestra "Scansione di controllo", selezionare l'opzione dello stack Z.
Inserire i seguenti parametri di scansione: Numero di fette: 5; intervallo: 0,5 micron; fetta corrente: 3.
Preparare un AccuBlock Digital bagno a (Labnet) a 37 ° C in prossimità del microscopio.
Riscaldare il buffer di imaging a 37 ° C.
Preparare la diapositiva memorizzato aspirando la PBS, sostituendola con 600 ml di buffer di immagini caldo.
Incubare il vetrino a 37 ° C. Tenere la diapositiva in incubatrice fino al passaggio 13, per almeno 15 min.
Raccogliere 5 × 10 ⁵ cellule T trasfettate.
Centrifugare le cellule per 2 minuti a 400 xg.
Scartare il surnatante.
Risospendere le cellule in 1 ml di tampone di imaging caldo, e trasferirli in una provetta Eppendorf da 1,5 ml.
Posizionare il ttubo est sul bagno a Digital AccuBlock.
Prendere il vetrino riscaldato dal termostato, e montarlo sul telaio di montaggio microscopio riscaldata.
Fare clic sull'icona "VIS".
Mescolare la sospensione cellulare e togliere 1-2 microlitri.
Inserire la punta della pipetta nel buffer di imaging di sopra del fondo della diapositiva. Evitare di graffiare il vetrino.
Seed le cellule sopra dell'apertura della oggettiva.
Immediatamente iniziare a tracciare visivamente le cellule fluorescenti mentre scendono. Selezionare una cella che mostra un'elevata fluorescenza in entrambi i canali.
Prima che la cella raggiunge la superficie del vetrino, attivare la modalità LSM.
Alterna un solo laser di eccitazione. Selezionare un laser per il quale si dispone di un canale DIC.
Impostare zoom a 1. Fare clic sull'icona "Fast XY". Fare clic sull'icona "Stop". Utilizzando lo strumento Ritaglia, selezionare un ROI centrata sulla cella.
Impostare zoom a 3. Fare clic sull'icona "Fast XY", quindi impostare manualmente la messa a fuoco per visualizzare in modo ottimale la cella. Fare clic su "Stop" icon.
Alternare tutti i laser di eccitazione necessari.
Avviare la registrazione facendo clic sull'icona "stARTT". Immagine della cella per la totalità del processo di spalmatura (comunemente 5 min). Al termine, fare clic sull'icona "Stop".
Salvare il file.
Per acquisire ulteriori celle, fare clic sull'icona "VIS". Se ci sono cellule che ancora non entrano in contatto con la parte inferiore della diapositiva, continuare dal punto 23. Evitare le cellule di imaging che hanno già iniziato il processo di diffusione. In caso contrario, passare al punto 32.
Se l'area diapositiva osservata è parte privi di cellule, aggiungere un'altra aliquota di cellule (continuare dal passo 20). In caso contrario, passare al punto 33.
Per acquisire ulteriori celle, spostare la slitta in modo che l'area al di sopra dell'apertura del obiettivo è privo di cellule.
Aggiungere un'altra aliquota di cellule (e continuare dal punto 20).
Dopo aver eseguito tutte le immagini desiderato, aprire un file salvato LSM.
Fare clic su "Galleria", "Time + Z" e "sottoinsieme".
Selezionare il relevant periodo e Z stack.
Salvare il nuovo file.
Eseguire i passaggi 35-38 per tutti i file di imaging.

4. Imaging Data Analysis

Aprire i file con il software LSM Imaris (Bitplane AG, Zurigo, Svizzera).
Fare clic su "Superare". Fare clic sul menu "Image Processing", e selezionare "Swap Tempo e Z". Questo aiuterà nella corretta ritaglio dell'immagine.
Fare clic su "Modifica" barra degli strumenti e selezionare l'opzione "3D Crop" nel menu a discesa. Ritagliare l'immagine per includere solo l'area che circonda la cellula. Ti consigliamo di ritagliare un quadrato di 300 × 300 pixel centrata sulla cella. Si noti che la forma e la posizione della cella possono cambiare nel tempo. Osservando l'asse t, assicurarsi che la cella è all'interno della regione ritagliata a tutti i tempi.
Fare clic sul menu "Image Processing", e selezionare "Swap Tempo e Z" per ripristinare la separazione temporale originale dell'immagine.
Premere il pulsante "Coloc" sulla barra degli strumenti principale. Selezionare "Tempo di costruzione Dep. Coloc ". Imaris calcola automaticamente le soglie di intensità per ogni canale ad ogni tempo.
Guarda i risultati dell'analisi colocalizzazione selezionando "Channel Statistiche". Esportare i dati facendo clic su "Esporta".
Ripetere i passaggi da 1 a 6 per ogni cella creata l'immagine. Si consiglia di almeno 50 cellule analizzate in questo modo.
Calcolare la media coefficiente di colocalizzazione di Pearson e il suo errore standard o scarto.