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Articolo metodologico

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

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DOI:

10.3791/50079

⸱

19 gennaio 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg , 2Centre of Chronic Immunodeficiency (CCI), University Medical Centre Freiburg, University of Freiburg

In questo articolo

Sommario

Gli astrociti sono stati riconosciuti per essere versatili cellule che partecipano a processi biologici fondamentali che sono essenziali per il normale sviluppo del cervello e la funzione, e la riparazione del sistema nervoso centrale. Qui vi presentiamo una procedura rapida per ottenere colture pure astrociti topo per studiare la biologia di questa classe importante di cellule del sistema nervoso centrale.

Abstract

Gli astrociti sono un tipo di cellula abbondante nel cervello dei mammiferi, ma resta ancora molto da imparare sulle loro caratteristiche molecolari e funzionali. Nei sistemi di coltura in vitro di cellule astrociti possono essere utilizzati per studiare le funzioni biologiche di queste cellule gliali in dettaglio. Questo protocollo video mostra come ottenere astrociti puri di isolamento e la coltura di cellule corticali miste di cuccioli di topo. Il metodo si basa sulla mancanza di neuroni vitali e la separazione di astrociti, oligodendrociti e microglia, le tre popolazioni principali cellule gliali del sistema nervoso centrale, in coltura. Immagini rappresentative durante i primi giorni di cultura dimostrare la presenza di una popolazione cellulare mista e indicare il timepoint, quando astrociti diventano confluenti e devono essere separati da microglia e gli oligodendrociti. Inoltre, abbiamo dimostrato la purezza e la morfologia degli astrociti di astrociti in coltura utilizzando colorazioni immunocitochimiche per la consolidata eappena descritto marcatori astrociti. Questo sistema di coltura può essere facilmente utilizzato per ottenere astrociti topo puri e astrociti terreno condizionato per studiare vari aspetti della biologia astrociti.

Introduzione

Astrociti sono un tipo cellulare molto abbondante nel sistema nervoso centrale (CNS). Il rapporto tra astrociti ai neuroni è di 1:3 nella corteccia di topi e ratti, mentre ci sono 1,4 astrociti per neurone nella corteccia umana 1. L'interesse per la funzione degli astrociti è aumentato drammaticamente negli ultimi anni. Una funzione chiave degli astrociti è il loro ruolo di supporto strutturale e metabolico ai neuroni 2,3. Ruoli di recente scoperta per gli astrociti coprono un ampio spettro di funzioni. Questi includono guidare la migrazione degli assoni di sviluppo e alcuni neuroblasti durante lo sviluppo 4-6, funzioni nella trasmissione sinaptica, forza sinapsi e di elaborazione delle informazioni da circuiti neurali 7-9, ruoli nella barriera ematoencefalica (BBB) ​​formazione 10 e 11-13 integrità e la regolamentazione del 14 tono cerebrovascolare. Un'altra caratteristica importante di astrociti è la loro risposta al danno. In condizioni patologiche astrocytes diventano reattive e upregulate ulteriormente l'espressione della proteina di filamento intermedio acida fibrillare gliale (GFAP) e inibitori della matrice extracellulare (ECM) proteine ​​15,16. Astrociti reattivi delimitare il luogo di ferita da tessuto sano formando una cicatrice gliale, che consiste principalmente di proteine ​​secrete astrociti ECM del condroitin solfato proteoglicani (CSPG) famiglia, i principali fattori che inibiscono la rigenerazione assonale dopo lesione del SNC 15-17.

Gli astrociti sono originari di radiali gliali (RG), le cellule durante l'embriogenesi e all'inizio della vita post-natale. Secondo le specifiche astrociti si è verificato, precursori degli astrociti migrare verso le loro posizioni finali, dove iniziare il processo di differenziazione terminale. In vivo, astrociti sembrano essere maturi tre o quattro settimane dopo la nascita come indicato dalla loro morfologia tipica 18,19. Una sottopopolazione di cellule RG convertire in zona subventricolare astrociti (cellule di tipo B). Both, RG e le cellule di tipo B funzionano come astrociti-come le cellule staminali neurali (NSC) durante lo sviluppo e nell'adulto, rispettivamente. Come astrociti, RG e le cellule di tipo B anche esprimere la astrociti specifico trasportatore del glutammato (GLAST), lipidi del cervello-binding protein (BLBP), e GFAP, indicando che questi indicatori non possono essere utilizzati esclusivamente per etichettare specificamente astrociti adulti. In contrasto adulti astrociti parenchimali, che non si dividono nel cervello sano, RG e B tipo cellule mostra potenziale di cellule staminali, come la capacità di auto-rinnovarsi. Disregolazione di astrociti è stato implicato in numerose patologie, compreso il morbo di Alzheimer 20,21, malattia di Huntington 22, morbo di Parkinson 23, 24 Rett sindrome e malattia di Alexander 25. Inoltre, astrociti reagire a tutte insulti del SNC, portando all'attivazione astrociti e astrocitica formazione della cicatrice gliale 16,26. La cicatrice che si forma astrocitari gliale tr seguente cervelloAUMA midollo spinale o lesioni è pensato per essere la barriera principale impedire la rigenerazione neuronale 15.

Lo sviluppo di metodi affidabili per isolare e mantenere popolazioni purificate di cellule è stato fondamentale per la nostra comprensione del sistema nervoso. Lavoro pionieristico da McCarthy e de Vellis consente agli investigatori di data per preparare colture quasi pure di astrociti da tessuti di ratto neonato 27. Molto è stato appreso sulla biologia astrociti utilizzando questo metodo, che viene qui presentata in una forma leggermente modificata per isolare gli astrociti corticali di topo. Integrando studi in vivo, astrociti nonché mezzo condizionato ottenuto utilizzando la coltura in vitro descritto, sono strumenti utili per ottenere ulteriori approfondimenti funzioni astrociti.

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Protocollo

1. L'isolamento e la placcatura di misti cellule corticali

Mixed isolamento cellulare corticale per colture astrociti può essere eseguita utilizzando P1 a P4 cuccioli di topo. Al fine di ottenere la giusta densità astrociti è necessario utilizzare 4 cortecce topo pup per T75 pallone di coltura tissutale. Pertanto, volumi nel seguente protocollo sono calcolati per un preparato cellulare utilizzando 4 cuccioli di topo.

  1. Prima di avviare la procedura di dissezione, preriscaldata 30 ml di mezzo di coltura di astrociti (DMEM, glucosio + 10% di siero fetale di siero bovino + 1% di penicillina / streptomicina, vedi tabella) a 37 ° C. Coat uno T75 pallone con 20 ml di poli-D-lisina (PDL) ad una concentrazione di 50 ug / ml in acqua di grado coltura cellulare per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2.
  2. Per la procedura di dissezione, preparare tutti i reagenti necessari e materiali. Avrete bisogno di: forbici chirurgiche, lisce una pinza sottile, pinze punta piatta, asciugamani di carta, sacchetto di rifiuti, il 70% di etanolo und 2 piatti dissezione (3.5 cm di diametro) sul ghiaccio riempito con 2 HBSS ml ciascuno.
  3. Premere delicatamente e spruzzare la testa e il collo del mouse cucciolo con il 70% di etanolo. L'animale viene sacrificato per decapitazione usando le forbici.
  4. Eseguire una incisione mediana, posteriore a anteriore, lungo il cuoio capelluto per rivelare il cranio.
  5. Tagliare il cranio con cura dal collo al naso. Due ulteriori tagli vengono eseguiti per permettere ulteriore accesso al cervello: Il primo taglio è fatto anteriore dei bulbi olfattivi, l'altra inferiore del cervelletto di scollegare il cranio dalla base del cranio.
  6. Utilizzando le pinze punta piatta, i lembi cranici sono gentilmente girato di lato e il cervello viene estratto e inserito nel primo piatto dissezione pieno di HBSS. Porre la capsula posteriore su ghiaccio e continuare a raccogliere tutti e 4 i cervelli.
  7. Il resto della procedura di dissezione è eseguita sotto uno stereomicroscopio. In primo luogo, i bulbi olfattivi e il cervelletto vengono rimossi con l'ammendadissettore (Figura 1B).
  8. Al fine di recuperare le cortecce, afferrare l'estremità posteriore del cervello con le pinza sottile, eseguire una incisione mediana tra i due emisferi, inserire una seconda serie di pinze al boschetto creato e rimuovere la piastra-come la struttura della corteccia dal cervello.
  9. Attenzione sezionare le meningi dagli emisferi della corteccia tirando con la pinza fini (Figura 1D '). Questo passaggio consente di evitare la contaminazione della cultura finale astrociti da cellule meningee e fibroblasti. Trasferire gli emisferi della corteccia preparati nel secondo piatto pieno di HBSS e restituirlo su ghiaccio. Continuare quindi con tutti e 4 cortecce.
  10. Infine, tagliare ogni emisfero corteccia in piccoli pezzi con lame affilate (circa 4 a 8 volte).
  11. In condizioni sterili, pezzi di corteccia di trasferimento in un unico tubo da 50 ml Falcon e aggiungere HBSS ad un volume totale di 22,5 ml.
  12. Aggiungere 2,5 ml di 2,5% tripsina, mescolare e incubareil tessuto nel bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min. Mescolare occasionale agitando ogni 10 min.
  13. Centrifugare per 5 minuti a 300 xg per pellet pezzi di tessuto della corteccia.
  14. Rimuovere con attenzione il surnatante per decantazione. Al fine di evitare di perdere il tessuto pellet si può trattenere meccanicamente utilizzando una pipetta. Dissociare il tessuto in una sospensione cellulare singola aggiungendo 10 ml di mezzo di placcatura astrociti e vigorosa pipettaggio utilizzando una pipetta di plastica da 10 ml fino pezzi di tessuto sono dissociate in singole cellule (20 a 30 volte). Regolare il volume a 20 ml con media placcatura astrociti. La possibilità di controllare la dissociazione del tessuto corticale in cellule singole contando utilizzando un hematocytometer. Una preparazione di 4 cortecce topo cucciolo dovrebbe produrre 10-15 x10 6 cellule dissociate singole.
  15. Aspirare PDL dalla fiasca T75 cultura, piastra sospensione dissociato singola cella e incubare a 37 ° C in incubatore CO 2.

2. Come ottenere un Enriched Cultura astrociti

  1. Modificare le medie 2 giorni dopo la placcatura delle cellule miste corticali e tutti i 3 giorni successivi.
  2. Dopo 7-8 giorni, quando microglia astrociti sono confluenti e sovrapposizione sedersi esposta sullo strato astrociti o sono già staccati dallo strato astrociti (Figura 2), agitare il matraccio T75 a 180 rpm per 30 minuti su un agitatore orbitale per rimuovere microglia. Eliminare il supernatante contenente microglia o se si desidera esaminare la cultura e la microglia, che spin down e piastra per la cultura 28,29.
  3. Aggiungere 20 ml di mezzo fresco cultura astrociti e proseguire con agitando a 240 rpm per 6 ore per rimuovere le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Poiché alcuni OPC non si stacchi dallo strato di astrociti, continuano ad agitare vigorosamente per 1 minuto, al fine di prevenire la contaminazione OPC. Eliminare il surnatante o girare verso il basso e piatto, se si desidera la cultura OPC 29.
  4. Sciacquare il restante confluestrato nt astrociti due volte con PBS, aspirare il PBS, aggiungere 5 ml di tripsina-EDTA e incubare in 2 CO incubatore a 37 ° C. Controllare distacco di astrociti ogni 5 min e far rispettare il distacco di astrociti colpendo il pallone contro il palmo della mano (2-3 volte).
  5. Dopo astrociti sono staccati dal pallone cultura, aggiungere 5 ml di terreno di coltura astrociti, cellule di spin a 180 xg per 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 40 ml di terreno fresco placcatura astrociti. Un pallone di coltura di tessuti T75 dovrebbe produrre circa 1x10 6 cellule dopo la scissione prima cella. Celle a piastre in due fiasche T75 e incubare a 37 ° C in 2 CO incubatore. Cambiare il mezzo ogni 2 o 3 giorni.
  6. 12-14 giorni dopo il primo split astrociti sono placcati in un apposito concentrazione cellulare 24-48 ore prima di eseguire l'esperimento. Un pallone di coltura di tessuti T75 dovrebbe produrre circa 1,5-2 x10 6 cellule dopo la divisione seconda cella.

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Risultati

Sull'isolamento del cervello di topo completa (Figura 1A), il cervelletto e bulbi olfattivi devono essere rimossi (Figura 1B). Le cortecce sono sbucciati del tronco cerebrale mouse (Figura 1C) e meningi della corteccia individuale (Figura 1D ') sono attentamente rimossi (Figura 1E). Meningi sono evidenti dal sistema arteria meningea e risultati incompleti rimozione della contaminazione della cultura finale astrociti da cellule m...

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Discussione

Il metodo qui descritto si basa sulla preparazione cultura astrociti dal cervello di roditori neonatali, originariamente descritti da McCarthy e de Vellis nel 1980 27. Il metodo modificato di isolamento e la coltura di astrociti corticali da P1 postnatale al cervello P4 del mouse qui presentato è veloce, rese astrociti primari puri ed è altamente riproducibile. Questa tecnica può essere facilmente trasferiti per isolare astrociti da altre specie, come di ratto o di maiale e da altre regioni del cervello, come...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Supportato dalla Fondazione Fazit Graduate borsa di studio per SS, il Ministero federale dell'Istruzione e della ricerca (BMBF 01 EO 0803) a KB e della Commissione europea sovvenzione 7 ° PQ PIRG08-GA-2010-276989, Neurex, e il tedesco Research Foundation Grant SCHA 1442 / 3-1 per CS Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome della soluzione di lavoro Azienda Numero di catalogo Concentrazione finale
Terreni di coltura astrociti
DMEM, glucosio Life Technologies 31966-021
FBS, inattivato al calore Life Technologies 10082-147 Concentrazione finale: 10%
Penicillina-Streptomicina Life Technologies 15140-122 Concentrazione finale: 1%
Soluzione per scavare tessuto cerebraleestion
HBSS Life Technologies 14170-088
2,5% tripsina Life Technologies 15090-046 Concentrazione finale: 0,25%
Altro
70% (vol / vol) di etanolo Roth 9.065,2
Poli-D-lisina Millipore A-003-E 50 ug / ml
Acqua PAA S15-012 coltura cellulare grade
PBS PAA H15-002 coltura cellulare grade
0,05% ProvaPSIN-EDTA Life Technologies 25300-062
Filtro da 0,45 micron sterile Sartorius 16555
3,5 centimetri Petri BD Falcon 353001
15 ml Falcon tubo BD Falcon 352096
50 ml Falcon tubo BD Falcon 352070
75 centimetri 2 pallone di coltura tissutale BD Falcon 353136
Pinze, fine Dumont 2-1032, 2-1033 # 3c; # 5
Pinze, punta piatta KLS Martin 12-120-11
13 centimetri forbici chirurgiche Aesculap BC-140-R
Stereomicroscopio Leica MZ7.5
Stereomicroscopio + Fotocamera Leica MZ16F; DFC320
Microscopio + Fotocamera Zeiss, Canon Primo Vert; PowerShot A650 IS
Centrifuga Eppendorf 5805000.017 Centrifuge5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450
Bagnomaria Julabo SW20, 37 ° C

Riferimenti

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