Proteine ​​trasfezione di polmone mouse

Sommario

Topi transgenici o vettori virali sono stati usati per aumentare l'espressione della proteina all'interno del polmone. Tuttavia, queste tecniche sono lunghi, tecnicamente complesse e hanno effetti off-target che possono confondere i risultati. Il nostro protocollo di trasfezione proteina utilizza un reagente di trasfezione basata lipidico e un MICROIRRIGATORE ultrafine per fornire uniformemente proteina attiva di cellule polmonari.

Abstract

Aumentare l'espressione della proteina permette ai ricercatori di comprendere meglio il ruolo funzionale di quella proteina nella regolazione dei processi biologici chiave ^1. Nel polmone, questo è stato realizzato tipicamente attraverso approcci genetici che utilizzano topi transgenici ^2,3 o vettori virali o non virali che elevano livelli di proteina tramite incremento dell'espressione genica ^4. Topi transgenici sono costosi e che richiede tempo per generare e l'inserzione casuale di un'espressione genica transgene o cronica possono alterare il normale sviluppo del polmone e quindi limitare l'utilità del modello ^5. Mentre transgenici condizionali scongiurare problemi associati con l'espressione genica cronica ^6, le transattivatore (rtTA) topi tetraciclina controllati inversa, che vengono utilizzati per generare un'espressione condizionale, sviluppano spontanea allargamento dello spazio aereo ^7. Come con transgenici, l'uso di vettori virali e non virali è costoso ⁸ e può provocare dose-drisposte infiammatorie ependent che confondono risultati ⁹ e ostacolano l'espressione ^10. Inoltre, l'efficacia di dosi ripetute sono limitati dalla migliorate le risposte immunitarie al vettore ^11,12. I ricercatori stanno sviluppando associati adeno-virale (AAV) vettori che provocano meno infiammazione e hanno un'espressione più lunga all'interno del polmone ^13.

Utilizzando β-galattosidasi, presentiamo un metodo per aumentare l'espressione di proteine ​​rapidamente ed efficacemente all'interno del polmone utilizzando una tecnica diretta trasfezione proteina. Questo protocollo mescola una quantità fissa di proteina purificata con 20 pl di un reagente di trasfezione base lipidica (Pro-Ject, Pierce Bio) per consentire la penetrazione nel tessuto polmonare stesso. La miscela proteica liposomiale viene poi iniettato nei polmoni dei topi attraverso la trachea utilizzando un MICROIRRIGATORE (Century Penn, Philadelphia, PA). Il MICROIRRIGATORE genera un bel pennacchio di aerosol liquidi durante i polmoni. Utilizzando la tecnicaabbiamo dimostrato deposizione uniforme della proteina iniettata durante le vie aeree e gli alveoli dei topi ^14. La tecnica di transfezione lipidi permette l'uso di una piccola quantità di proteine ​​per realizzare l'effetto. Questo limita la risposta infiammatoria che altrimenti sarebbe provocata dalla somministrazione di proteine. Infatti, con questa tecnica abbiamo pubblicato che siamo stati in grado di aumentare in modo significativo l'attività PP2A nel polmone senza influire polmone lavanda cellularità ^15. Polmone lavanda cellularità preso 24 ore dopo sfida era paragonabile ai controlli (27 ± 4 Controllo vs 31 ± 5 albumina transfettate; N = 6 per gruppo). Inoltre, i livelli di proteina aumenta senza indurre alterazioni dello sviluppo polmonare o modifiche architettoniche che si possono verificare in modelli transgenici. Tuttavia, la necessità di ripetute somministrazioni può rendere questa tecnica meno favorevole per studi di esaminare gli effetti di incremento a lungo termine nell'espressione proteica. Ciò sarebbe particolarmente true per le proteine ​​con breve emivita.

Protocollo

1. Preparazione di proteine ​​Transfezione reagente

1. Sciogliere il reagente Pro-Ject aggiungendo 250 ml di metanolo e cloroformio al tubo contenente il film secco.
2. Vortex per 10-20 secondi alla massima velocità.
3. Pipettare 20 ml di reagente di Pro-Ject in tubi microcentrifuga separate.
4. Evaporare il solvente ponendo le provette da microcentrifuga contenenti il ​​reagente Pro-Ject sotto cappa a flusso laminare per un minimo di 6 ore a temperatura ambiente. Esso deve essere completamente asciutto. Alternativamente, essiccare il reagente Pro-Ject utilizzando un essiccatore a vuoto.
5. Conservare le provette a -20 ° C. Essi so....

Risultati

Per dimostrare l'efficacia della nostra tecnica abbiamo usato una MICROIRRIGATORE (Penn sec) per iniettare la trachea di topi con 2 pg di topo albumina (Sigma) disciolto in 50 ml di PBS che conteneva 20 ml di reagente di trasfezione Pro-Ject. I topi trattati con albumina sono stati confrontati con i topi che sono stati trattati in modo identico con 2 mg di proteina beta-galattosidasi (Pierce Bio). Dopo ventiquattro ore, i topi sono stati sacrificati ed i polmoni sono stati processati per l'analisi istologi.......

Discussione

Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi è che produce aumenti dei livelli della proteina e l'attività all'interno del tessuto polmonare stesso. Inoltre, penetra alle regioni più distali del polmone rispetto a stare solo all'interno delle vie respiratorie. Abbiamo misurato un aumento dell'attività delle proteine ​​del nostro iniettato anche dopo lavaging le vie aeree con soluzione fisiologica ^15. Analisi di attività del tessuto indicano che la proteina sta entrando cellule e non.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microspruzzatore Pro-Ject	Pierce Bio	89850
	Penn Century	FMJ-250
Beta-galattosidasi	Pierce Bio	89850
Anticorpo beta-galattosidasi	Santa Cruz Bio	SC-19119
Albumina sierica di topo	Sigma Aldrich	A3139
Ketamina/xilazina	Sigma Aldrich	K113