Descriviamo qui il funzionamento di un dispositivo microfluidico che permette continuo e ad alta risoluzione di immagini microscopiche di cellule di lievito in erba singole durante la loro replicazione completa e / o durata cronologica.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Continuo ad alta risoluzione osservazione microscopica di replicativo invecchiamento nel lievito germogliante
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dimostriamo l'uso di una semplice impostazione microfluidica, in cui le cellule di lievito in erba singole possono essere monitorati in tutto il loro intero ciclo di vita. Il chip microfluidica sfrutta la differenza di dimensioni tra madre e figlia cellule utilizzando un array di micropads. Su caricamento, le cellule sono intrappolati sotto queste micropads, perché la distanza tra la Micropad e il vetro di copertura è simile al diametro di una cellula di lievito (3-4 micron). Dopo la procedura di caricamento, mezzo di coltura viene alimentata continuamente attraverso il chip, che non soltanto crea un ambiente costante e definita in tutto l'intero esperimento, ma anche elimina le cellule figlie emergenti, non trattenuti sotto le pastiglie a causa della loro dimensione. Il setup conserva cellule madri modo così efficiente che in un singolo esperimento fino a 50 singole cellule possono essere monitorati in modo completamente automatizzato per 5 giorni o, se necessario, più lungo. Inoltre, le eccellenti proprietà ottiche del chip permettono elevatoImmagini a risoluzione di cellule durante l'intero processo di invecchiamento.
Introduzione
Gemmazione lievito è un importante organismo modello per la ricerca di invecchiamento 1. Fino a poco studiando replicativa invecchiamento in cellule di lievito è un processo complesso che richiede un metodo di dissezione, in cui ciascuna gemma stata rimossa manualmente dalla cellula madre 2,3. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente presentato una nuova impostazione microfluidica in grado di tenere traccia di cellule madri singole in tutto il loro intero ciclo di vita 4.
Nel nostro chip microfluidica, le cellule di lievito sono intrappolati sotto morbide micropads a base di elastomeri (vedi
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Produzione e preparazione di un wafer di silicio Mold
Chip microfluidici sono creati da uno stampo wafer di silicio prodotto da litografia morbida. Questi wafer possono essere riutilizzati più volte per produrre chip microfluidici. È opportuno che la produzione di un rispettivo wafer viene eseguita da un gruppo specializzato nella microfluidica 6.
Il wafer è realizzato in un processo di fotolitografia due fasi utilizzando due diversi strati di fotoresist negativo, SU-8 7. Lo strato inferiore è utilizzato per generare la zona di cattura cella (SU-8 2002; altezza 3-4 micron), mentre i cana....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
In questo protocollo, le cellule vengono caricati nel chip microfluidica direttamente da coltura metà esponenziale. Per accertare se la distribuzione dell'età di cellule intrappolate nel chip microfluidica è simile a quella della coltura prima del carico, le cellule sono state colorate con grano agglutinin coniugato a FITC (WGA-FITC) per visualizzare cicatrici gemma. Come visibile in figura 3, l'intrappolamento delle cellule sotto le micropads del chip microfluidica non è polarizzato a cellule d.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il metodo microfluidica descritto qui è un importante strumento di romanzo in ricerca di invecchiamento in quanto permette semplice e automatizzato generazione di lievito replicative dati di durata della vita in combinazione con immagini in sequenza ad alta risoluzione. Questi attributi sono importanti miglioramenti rispetto alle possibilità sperimentali del metodo classico dissezione, ma ci sono alcune limitazioni del metodo che devono essere presi in considerazione.
Si noti che la durata d.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Laura Schippers per scrivere le prime versioni del protocollo di carico delle cellule e Marcus de Goffau e Guille Zampar per aver morfologie mitocondriali.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomero | Mavom bv | 1060040 | Questa confezione contiene la base PDMS e l'agente indurente PDMS. |
| Piastre di Petri in vetro 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Occhiali di copertura 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Foglio | |||
| Tazza | |||
| Pipetta sierologica 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Nastro adesivo | VWR International | 819-1460 | |
| Pasta Baysilone (siliconi GE Bayer) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| Tubo microforo in PTFE, 0,012"ID x 0,030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Indicato come tubo sottile |
| Tubo microborato Tygon, 0,030"ID x 0,090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Indicato come tubo spesso |
| Bisturi | VWR International | 233-5334 | |
| Siringhe Luer-Lok da 50 ml | 300137 | ||
| siringhe BD da 5 ml, pinzette Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| VWR International | 232-2132 | ||
| Tronchetti Luer calibro 20 | Instech Solomon | LS20 | |
| Filtri per siringhe (dimensione dei pori 0,20 μ m) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Tappo per catetere in acciaio inossidabile, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Piastre di Petri | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Detergente per ozono UV da banco | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Pompa Harvard 11 Apparecchio Harvard Elite | 70-4505 | ||
| SU-8 Stampo master in silicone (wafer) | Autocostruito; Per i dettagli contattare l'autore corrispondente | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Pompa per vuoto | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Essiccatore | VWR International | 467-2115 | |
| Piastra riscaldante | VWR International | 460-3267 | |
| Opzionale: Supporto in metallo per vetro di copertura (22x40 mm) | Autoprodotto; Per i dettagli contattare l'autore corrispondente | ||
| (Fluorescenza) Microscopio con obiettivo 60x, autofocus, capacità time-lapse e preferibilmente un tavolino automatizzato (controllo XY motorizzato) | Nikon | Eclipse Ti-E |
Riferimenti
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Esplora altri articoli
