Descriviamo qui il funzionamento di un dispositivo microfluidico che permette continuo e ad alta risoluzione di immagini microscopiche di cellule di lievito in erba singole durante la loro replicazione completa e / o durata cronologica.
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Articolo metodologico
Continuo ad alta risoluzione osservazione microscopica di replicativo invecchiamento nel lievito germogliante
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dimostriamo l'uso di una semplice impostazione microfluidica, in cui le cellule di lievito in erba singole possono essere monitorati in tutto il loro intero ciclo di vita. Il chip microfluidica sfrutta la differenza di dimensioni tra madre e figlia cellule utilizzando un array di micropads. Su caricamento, le cellule sono intrappolati sotto queste micropads, perché la distanza tra la Micropad e il vetro di copertura è simile al diametro di una cellula di lievito (3-4 micron). Dopo la procedura di caricamento, mezzo di coltura viene alimentata continuamente attraverso il chip, che non soltanto crea un ambiente costante e definita in tutto l'intero esperimento, ma anche elimina le cellule figlie emergenti, non trattenuti sotto le pastiglie a causa della loro dimensione. Il setup conserva cellule madri modo così efficiente che in un singolo esperimento fino a 50 singole cellule possono essere monitorati in modo completamente automatizzato per 5 giorni o, se necessario, più lungo. Inoltre, le eccellenti proprietà ottiche del chip permettono elevatoImmagini a risoluzione di cellule durante l'intero processo di invecchiamento.
Introduzione
Gemmazione lievito è un importante organismo modello per la ricerca di invecchiamento 1. Fino a poco studiando replicativa invecchiamento in cellule di lievito è un processo complesso che richiede un metodo di dissezione, in cui ciascuna gemma stata rimossa manualmente dalla cellula madre 2,3. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente presentato una nuova impostazione microfluidica in grado di tenere traccia di cellule madri singole in tutto il loro intero ciclo di vita 4.
Nel nostro chip microfluidica, le cellule di lievito sono intrappolati sotto morbide micropads a base di elastomeri (vedi Figura 1). Un flusso continuo di medie lava via cellule figlie di nuova formazione e fornisce le cellule con sostanze nutritive fresche. In un singolo esperimento, fino a 50 cellule madri possono essere monitorati in modo completamente automatico durante il loro intero ciclo di vita replicativa. A causa delle eccellenti proprietà ottiche del chip microfluidica, è possibile monitorare contemporaneamente diversi aspetti della biologia delle cellule di lievito (es , utilizzando proteine fluorescenti).
Rispetto al metodo classico dissezione, la configurazione microfluidica offre notevoli vantaggi. Si garantisce un ambiente definito e costante durante l'intero esperimento invecchiamento. Non richiede attrezzature specializzate costoso e può essere eseguito su qualsiasi microscopio dotato di messa a fuoco automatica e capacità di time-lapse, nonché di controllo della temperatura per la coltivazione delle cellule. La produzione e il funzionamento dei chip microfluidici possono essere apprese in pochi giorni. Inoltre, le cellule possono essere caricate direttamente da una coltura in crescita esponenziale, un vantaggio rispetto ad un altro metodo microfluidica recentemente pubblicato 5, che richiede biotinilazione di cellule madri. Combinato con un imaging ad alta risoluzione, il metodo qui descritto può essere usato per misurare cambiamenti graduali nella morfologia cellulare, l'espressione della proteina e localizzazione durante lievito invecchiamento in un modo senza precedenti. La possibilità dimonitoraggio a lungo termine di cellule singole fornisce anche possibilità uniche per studi ciclo cellulare del lievito.
un Questo metodo è stato recentemente ottimizzato per rimuovere la biotinilazione dal protocollo 16, che è stato pubblicato mentre questo manoscritto era in revisione.
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Protocollo
1. Produzione e preparazione di un wafer di silicio Mold
Chip microfluidici sono creati da uno stampo wafer di silicio prodotto da litografia morbida. Questi wafer possono essere riutilizzati più volte per produrre chip microfluidici. È opportuno che la produzione di un rispettivo wafer viene eseguita da un gruppo specializzato nella microfluidica 6.
Il wafer è realizzato in un processo di fotolitografia due fasi utilizzando due diversi strati di fotoresist negativo, SU-8 7. Lo strato inferiore è utilizzato per generare la zona di cattura cella (SU-8 2002; altezza 3-4 micron), mentre i canali sono realizzati con lo strato superiore (SU-8 2010; altezza 10 micron). Un'impressione del processo di produzione di wafer può essere trovato in Huang et al 8. I disegni dei chip microfluidici sono disponibili presso gli autori, nonché consigli su come ottenere un rispettivo wafer.
- Una volta che il wafer viene ottenuta, tagliare un pezzo di dura-Tag into sottili strisce di circa 0,5 mm per 3 mm con un bisturi e metterli attenzione sul wafer leggermente sopra la struttura di canale tra i canali di entrata e l'array Micropad (Figura 2A). Questo comporterà la formazione di un grande canale supplementare in ogni chip, che non sarà utilizzato solo durante il caricamento delle cellule, ma è anche importante per il funzionamento stabile del dispositivo microfluidica.
- Coprire il piatto di vetro Petri con un doppio strato di foglio di alluminio e mettere il wafer nella scatola di Petri. Il foglio di alluminio impedisce l'esecuzione in PDMS tra il wafer ed il piatto Petri. Se PDMS fa insinuarsi tra il wafer ed il piatto di vetro Petri, il wafer diventerà permanentemente fissata nella capsula di Petri. Sebbene il wafer è ancora utilizzabile, non sarà possibile sostituire il piatto di vetro Petri se si rompe e il PDMS dovrà essere tagliato in seguito.
2. Produzione di chip microfluidici
- Posizionare una plastica vuotacoppa sulla bilancia e tarare la bilancia. Versare 40 g di PDMS di base nella tazza di plastica (per un cm di diametro piatto di vetro Petri 12). Aggiungi PDMS catalizzatore con una pipetta monouso in rapporto p / w di 1:10, cioè circa 4 ml.
- Mescolare il PDMS e vulcanizzante accuratamente per parecchi minuti. Questo può essere fatto con la pipetta monouso utilizzato per pipettare il catalizzatore. E 'importante che la miscela sia ben mescolata prima di versare sulla parte superiore del wafer. Povero miscelazione causerà parte del PDMS non a polimerizzare.
- Versare il PDMS sopra il wafer nel piatto di vetro Petri.
- Miscelazione di PDMS con il catalizzatore porterà alla formazione di bolle nella miscela PDMS. Queste bolle devono essere rimossi prima del PDMS polimerizza. Il PDMS può essere degassato dopo versandolo sulla cima del wafer mettendo la piastra di Petri in un essiccatore collegato ad una pompa a vuoto. Con questa configurazione, ci vogliono circa 30 min per rimuovere tutte le bolle dalla miscela.
- Polimerizzare The PDMS ponendo capsula di Petri con la cialda sulla cima di una piastra calda a 120 ° C per 1 ora e poi a 65 ° C per un'altra ora.
- Rimuovere il foglio di alluminio insieme al wafer e polimerizzato PDMS dal piatto di vetro Petri. Staccare il foglio di alluminio e lo strato sottile di residuo polimerizzato PDMS dal retro del wafer. Lo strato di PDMS sopra il wafer può quindi essere separata dal wafer sollevandola attentamente.
- Posizionare lo strato di PDMS a testa in giù (con i canali verso l'alto) in panchina e ritagliare i disegni single chip impresse sul PDMS accuratamente con un bisturi. Cercare di trattenere circa 3 mm di PDMS attorno ai bordi dei canali per migliorare attaccamento del chip per il vetro di copertura in seguito.
- Eseguire fori PDMS alle estremità del canale di ingresso, uscita e laterale (Figura 2A) spingendo un 20 Gauge stub Luer tutto il percorso attraverso il PDMS in modo rettilineo.
Assicurarsi che il chip PDMSè ancora sdraiato a testa in giù sulla panca mentre punzonatura dei fori. Questo impedisce PDMS di attaccarsi alla parte interna del canale, che potrebbe causare il blocco del canale.
- Dopo la punzonatura ogni foro, rimuovere la colonna di PDMS nel stub Luer con le pinzette prima di tirare il mozzicone di nuovo fuori. La colonna PDMS potrebbe altrimenti rimanere dietro e bloccare il foro di appena un pugno.
- Pulire le superfici del chip da particelle di polvere e residui PDMS mettendo nastro adesivo su di esso e rimuovendo immediatamente il nastro nuovo. Allo stesso modo la pulizia del vetro di copertura a cui verrà allegato il chip.
- Posizionare il chip puliti e vetro di copertura sotto la lampada UV del banco UV-Ozono Cleaner. Le parti che devono essere legati insieme devono affrontare la lampada.
- Esporre il PDMS e vetro di copertura alla luce UV per 6-8 minuti e poi mettere direttamente il chip sul vetro coperchio posizionando le superfici esposte sopra l'altro.
- Battere delicatamente intorno ai lati del chippromuovere fissaggio della PDMS al vetro di copertura e per rimuovere eventuali bolle d'aria. Non toccare in cima alla struttura del canale in quanto ciò potrebbe causare la micropads di si attaccano al vetro di copertura pure.
- Posizionare il setup microfluidica appena fatto su un piatto caldo a 100 ° C per 60 min. Testare la forza del legame tra il vetro di copertura e il chip PDMS cercando di sollevare i bordi del chip PDMS leggermente. Quando il blocco PDMS non può essere sollevato dalla superficie del vetro, il legame è riuscita e il chip è pronto all'uso.
3. Preparazione del circuito integrato per cella di carico
Guasto di un dispositivo microfluidica può potenzialmente causare perdite di media nel microscopio. Per evitare questo, è consultivo utilizzare un supporto metallico e / o sigillare i lati del circuito integrato dove il PDMS incontra il vetro con smalto o colla epossidica. Questo impedisce la fuoriuscita del fluido nel caso del chip PDMS non è incollato abbastanza bene per il vetro di copertura. Anche il tuboconnessioni possono essere fissate attorno ai punti di inserzione in un modo simile per evitare la fuoriuscita del fluido. Un sensore di acqua fatto in casa che spegne la pompa a siringa in caso di perdite può essere usato come una precauzione di sicurezza in più. Disegni del metallo titolare appositamente per il chip microfluidica sono disponibili presso gli autori.
- Posizionare il chip microfluidica nel supporto metallico, con gel di silicone tra il vetro del chip e le parti metalliche della porta per creare una tenuta stagna. Avvitare i dadi delicatamente, per non rompere il vetro.
- Collegare tubi sottili (ca. lunga 5-15 cm) al canale laterale e il canale di uscita del chip. L'uso di pinzette rende più facile inserire il tubo nei fori perforati.
- Riempire un ml Luer-Lok siringa da 50 con terreno di coltura, rimuovere l'aria dalla siringa e collegarla in modo sequenziale ad un filtro a siringa, una calibro 20 stub Luer, un tubo di spessore corta (lunga ca. 2 cm) e di un tubo sottile. Assicurarsi che il sottile vascae è abbastanza lungo da coprire la distanza tra la pompa siringa e la fase microscopio.
- Posizionare la siringa nella pompa a siringa, l'avanzamento rapido della pompa fino a quando il tubo sottile è completamente riempito con il mezzo.
- Spingere il tubo sottile collegato alla siringa nel canale di entrata del chip e lasciare defluire mezzo attraverso il chip a 10 microlitri / min (Figura 2B). Raccogliere il mezzo lasciando il chip (ad esempio in una capsula di Petri). Il mezzo sarà eseguito mediante il canale laterale a causa della differenza tra la resistenza Duro-Tag reso grande canale laterale e il canale di uscita.
- Posizionare il chip in fase microscopio e impostare il fuoco del microscopio sui pad.
L'uso di obiettivi di immersione in olio è preferito rispetto quella di obiettivi immersione in acqua perché l'olio non secca nel tempo-corso dell'esperimento.
A seconda del microscopio ci potrebbero essere problemi con conservando il focus durante le prime ore di questo esperimento. Si consiglia pertanto di lasciare il chip per una o due ore in fase di microscopio in modo che possa stabilirsi prima di caricare le cellule e iniziare l'esperimento.
4. Caricamento di cellule di lievito nel chip microfluidica
- Collegare un ml Luer siringa da 5 a 20 Gauge stub Luer e un tubo di spessore (ca. 3 cm).
- Prelevare un campione della coltura cellulare per essere caricato nel chip.
La conta delle cellule preferito per caricamento è tra 1-5 x 10 6 cellule per ml. Culture con conta delle cellule più alte devono essere diluite prima del caricamento. Quando le cellule in cultura in YPD, efficienza di carico cella possono essere migliorate molte volte se le cellule vengono lavate con prima e risospese in terreno minimo contenente una percentuale simile al glucosio prima del caricamento. Durante il funzionamento del chip, YPD mezzo può ancora essere utilizzato in modo sicuro.
- Caricare circa 1 ml di sospensione cellulare in the siringa e rimuovere tutta l'aria dalla siringa.
- Diminuire la portata della pompa a siringa 0,5 microlitri / min. Il flusso basso e costante applicata dalla pompa siringa durante il caricamento (nel passo 4.5) spingerà cellule non iscritti mediante il canale laterale (Figura 2C).
- Collegare la siringa contenente la sospensione cellulare al tubo del canale di uscita. Caricare le celle premendo sullo stantuffo della siringa delicatamente. Osservare le cellule che entrano ed assestamento sotto le micropads via oculare o tramite lo schermo del computer.
- Mantenere la pressione sullo stantuffo fino a quando le cellule sufficienti sistemano sotto i pad. Il carico ottimale è di 1-3 cellule per pad. Come le cellule si depositano sotto le pastiglie a caso, è abbastanza comune che un paio di pastiglie non contengono le cellule e gli altri rilievi sono completamente pieni di cellule.
- Staccare la siringa usata per il carico delle cellule e il tubo di spessore ad esso collegato dal tubo sottile del canale di scarico, lavare la parte chAnnel per un paio di minuti a portate più elevate (10 microlitri / min) per rimuovere le bolle d'aria e / o cellule che ancora non escono il chip (Figura 2B). Se le cellule non vengono rimossi dal canale laterale, possono iniziare a crescere nel canale laterale e interferire con l'esperimento in seguito.
- Mettere il flusso della pompa a siringa indietro fino a 0,5 microlitri / min e chiudere il canale laterale fuori collegandolo ad un tubo di spessore (lungo circa 5 cm) contenente una spina catetere alla sua estremità (Figura 2D).
- Aumentare il flusso di una portata finale di 1-5 microlitri / min. La portata può variare a seconda di medie e ceppo di lievito.
- Avviare un filmato con le impostazioni del microscopio e la fotocamera adatta per l'obiettivo dell'esperimento. Assicurarsi che la velocità della fase di microscopio è impostata una velocità bassa che l'olio può seguire. Per la determinazione della durata della vita replicativa, celle di immagine ogni 10 min. Per proteggere le cellule dai minute quantità di luce UV emessa dalla alogenolampada, che è usato durante l'acquisizione DIC, è consigliabile utilizzare un filtro UV supplementare nel percorso ottico. Quando si utilizza la microscopia a fluorescenza, si preferisce un'immagine cellule minore frequenza (ad esempio ogni 20 min) per evitare effetti fototossiche. L'esperimento è completato quando tutte le celle caricate all'inizio dell'esperimento sono morti, che in condizioni normali richiede fino a 5 giorni. Si raccomanda di controllare regolarmente la messa a fuoco delle immagini durante l'esperimento e, se necessario, regolarlo.
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Risultati
In questo protocollo, le cellule vengono caricati nel chip microfluidica direttamente da coltura metà esponenziale. Per accertare se la distribuzione dell'età di cellule intrappolate nel chip microfluidica è simile a quella della coltura prima del carico, le cellule sono state colorate con grano agglutinin coniugato a FITC (WGA-FITC) per visualizzare cicatrici gemma. Come visibile in figura 3, l'intrappolamento delle cellule sotto le micropads del chip microfluidica non è polarizzato a cellule d...
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Discussione
Il metodo microfluidica descritto qui è un importante strumento di romanzo in ricerca di invecchiamento in quanto permette semplice e automatizzato generazione di lievito replicative dati di durata della vita in combinazione con immagini in sequenza ad alta risoluzione. Questi attributi sono importanti miglioramenti rispetto alle possibilità sperimentali del metodo classico dissezione, ma ci sono alcune limitazioni del metodo che devono essere presi in considerazione.
Si noti che la durata d...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Laura Schippers per scrivere le prime versioni del protocollo di carico delle cellule e Marcus de Goffau e Guille Zampar per aver morfologie mitocondriali.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomero | Mavom bv | 1060040 | Questa confezione contiene la base PDMS e l'agente indurente PDMS. |
| Piastre di Petri in vetro 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Occhiali di copertura 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Foglio | |||
| Tazza | |||
| Pipetta sierologica 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Nastro adesivo | VWR International | 819-1460 | |
| Pasta Baysilone (siliconi GE Bayer) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| Tubo microforo in PTFE, 0,012"ID x 0,030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Indicato come tubo sottile |
| Tubo microborato Tygon, 0,030"ID x 0,090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Indicato come tubo spesso |
| Bisturi | VWR International | 233-5334 | |
| Siringhe Luer-Lok da 50 ml | 300137 | ||
| siringhe BD da 5 ml, pinzette Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| VWR International | 232-2132 | ||
| Tronchetti Luer calibro 20 | Instech Solomon | LS20 | |
| Filtri per siringhe (dimensione dei pori 0,20 μ m) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Tappo per catetere in acciaio inossidabile, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Piastre di Petri | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Detergente per ozono UV da banco | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Pompa Harvard 11 Apparecchio Harvard Elite | 70-4505 | ||
| SU-8 Stampo master in silicone (wafer) | Autocostruito; Per i dettagli contattare l'autore corrispondente | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Pompa per vuoto | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Essiccatore | VWR International | 467-2115 | |
| Piastra riscaldante | VWR International | 460-3267 | |
| Opzionale: Supporto in metallo per vetro di copertura (22x40 mm) | Autoprodotto; Per i dettagli contattare l'autore corrispondente | ||
| (Fluorescenza) Microscopio con obiettivo 60x, autofocus, capacità time-lapse e preferibilmente un tavolino automatizzato (controllo XY motorizzato) | Nikon | Eclipse Ti-E |
Riferimenti
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
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