Continuo ad alta risoluzione osservazione microscopica di replicativo invecchiamento nel lievito germogliante

Summary

Descriviamo qui il funzionamento di un dispositivo microfluidico che permette continuo e ad alta risoluzione di immagini microscopiche di cellule di lievito in erba singole durante la loro replicazione completa e / o durata cronologica.

Abstract

Dimostriamo l'uso di una semplice impostazione microfluidica, in cui le cellule di lievito in erba singole possono essere monitorati in tutto il loro intero ciclo di vita. Il chip microfluidica sfrutta la differenza di dimensioni tra madre e figlia cellule utilizzando un array di micropads. Su caricamento, le cellule sono intrappolati sotto queste micropads, perché la distanza tra la Micropad e il vetro di copertura è simile al diametro di una cellula di lievito (3-4 micron). Dopo la procedura di caricamento, mezzo di coltura viene alimentata continuamente attraverso il chip, che non soltanto crea un ambiente costante e definita in tutto l'intero esperimento, ma anche elimina le cellule figlie emergenti, non trattenuti sotto le pastiglie a causa della loro dimensione. Il setup conserva cellule madri modo così efficiente che in un singolo esperimento fino a 50 singole cellule possono essere monitorati in modo completamente automatizzato per 5 giorni o, se necessario, più lungo. Inoltre, le eccellenti proprietà ottiche del chip permettono elevatoImmagini a risoluzione di cellule durante l'intero processo di invecchiamento.

Introduction

Gemmazione lievito è un importante organismo modello per la ricerca di invecchiamento ^1. Fino a poco studiando replicativa invecchiamento in cellule di lievito è un processo complesso che richiede un metodo di dissezione, in cui ciascuna gemma stata rimossa manualmente dalla cellula madre ^2,3. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente presentato una nuova impostazione microfluidica in grado di tenere traccia di cellule madri singole in tutto il loro intero ciclo di vita ^4.

Nel nostro chip microfluidica, le cellule di lievito sono intrappolati sotto morbide micropads a base di elastomeri (vedi

Protocol

1. Produzione e preparazione di un wafer di silicio Mold

Chip microfluidici sono creati da uno stampo wafer di silicio prodotto da litografia morbida. Questi wafer possono essere riutilizzati più volte per produrre chip microfluidici. È opportuno che la produzione di un rispettivo wafer viene eseguita da un gruppo specializzato nella microfluidica ^6.

Il wafer è realizzato in un processo di fotolitografia due fasi utilizzando due diversi strati di fotoresist negativo, SU-8 ^7. Lo strato inferiore è utilizzato per generare la zona di cattura cella (SU-8 2002; altezza 3-4 micron), mentre i cana....

Results

In questo protocollo, le cellule vengono caricati nel chip microfluidica direttamente da coltura metà esponenziale. Per accertare se la distribuzione dell'età di cellule intrappolate nel chip microfluidica è simile a quella della coltura prima del carico, le cellule sono state colorate con grano agglutinin coniugato a FITC (WGA-FITC) per visualizzare cicatrici gemma. Come visibile in figura 3, l'intrappolamento delle cellule sotto le micropads del chip microfluidica non è polarizzato a cellule di una ce.......

Discussion

Il metodo microfluidica descritto qui è un importante strumento di romanzo in ricerca di invecchiamento in quanto permette semplice e automatizzato generazione di lievito replicative dati di durata della vita in combinazione con immagini in sequenza ad alta risoluzione. Questi attributi sono importanti miglioramenti rispetto alle possibilità sperimentali del metodo classico dissezione, ma ci sono alcune limitazioni del metodo che devono essere presi in considerazione.

Si noti che la durata d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DC Sylgard 184 elastomero	Mavom bv	1060040	Questa confezione contiene la base PDMS e l'agente indurente PDMS.
Piastre di Petri in vetro 120/20 mm	VWR International	391-2850
Occhiali di copertura 22x40 mm	CBN Labsuppliers BV	190002240
Tough-Tags	Sigma-Aldrich	Z359106
Foglio
Tazza
Pipetta sierologica 5 ml	VWR International	612-1245
Nastro adesivo	VWR International	819-1460
Pasta Baysilone (siliconi GE Bayer)	Sigma-Aldrich	85403-1EA
Tubo microforo in PTFE, 0,012"ID x 0,030"OD	Cole Parmer	EW-06417-11	Indicato come tubo sottile
Tubo microborato Tygon, 0,030"ID x 0,090"OD	Cole Parmer	EW-06418-03	Indicato come tubo spesso
Bisturi	VWR International	233-5334
Siringhe Luer-Lok da 50 ml	300137
siringhe BD da 5 ml, pinzette Luer tip	VWR International	613-1599
	VWR International	232-2132
Tronchetti Luer calibro 20	Instech Solomon	LS20
Filtri per siringhe (dimensione dei pori 0,20 μ m)	Sigma-Aldrich	16534K
Tappo per catetere in acciaio inossidabile, 20 ga x12 mm	Instech Solomon	SP20/12
Piastre di Petri	VWR International	391-0892
EQUIPMENT
Detergente per ozono UV da banco	NOVA Scan	PSD-UVT
Pompa Harvard 11 Apparecchio Harvard Elite		70-4505
SU-8 Stampo master in silicone (wafer)			Autocostruito; Per i dettagli contattare l'autore corrispondente
Balance	Sartorius corporation	ED4202S
Pompa per vuoto	KNF Neuberger	N022 AN.18
Essiccatore	VWR International	467-2115
Piastra riscaldante	VWR International	460-3267
Opzionale: Supporto in metallo per vetro di copertura (22x40 mm)			Autoprodotto; Per i dettagli contattare l'autore corrispondente
(Fluorescenza) Microscopio con obiettivo 60x, autofocus, capacità time-lapse e preferibilmente un tavolino automatizzato (controllo XY motorizzato)	Nikon	Eclipse Ti-E