Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

Sommario

Kv canale disfunzione è associata ad aritmie cardiache. Al fine di studiare i meccanismi molecolari che portano a tali aritmie che utilizziamo un protocollo sistematico per l'isolamento di cardiomiociti atriali e ventricolari da Kv topi knockout subunità dei canali ausiliari. Cardiomiociti isolati possono essere utilizzate immediatamente per cellulari studi elettrofisiologici, biochimici o di immunofluorescenza (IF) saggi.

Abstract

KCNE geni codificano per una piccola famiglia di Kv canale subunità accessorie che formano complessi con eteromerici Kv canale subunità alfa di modificare le loro proprietà funzionali. Mutazioni in geni KCNE sono stati trovati in pazienti con aritmia cardiaca, come la sindrome del QT lungo e / o fibrillazione atriale. Tuttavia, precisa la fisiopatologia molecolare che porta a queste malattie resta sfuggente. In studi precedenti le proprietà elettrofisiologiche della malattia che provoca mutazioni in questi geni sono in gran parte state studiate in sistemi di espressione eterologa e non possiamo essere sicuri se gli effetti segnalati possono essere direttamente tradotti in cardiomiociti nativi. Nel nostro laboratorio abbiamo quindi utilizzare un approccio diverso. Siamo direttamente studiare gli effetti della delezione del gene KCNE in cardiomiociti isolati da topi knockout per elettrofisiologia cellulare - una tecnica unica che descriviamo in questo numero del Journal of esperimenti visualizzati. I cuori di geneticatopi ingegnerizzati KCNE lly stanno rapidamente asportato e montato su un apparato Langendorff da incannulazione aortica. Gratuito Ca ^{2 +} nel miocardio è vincolato da EGTA, e la dissociazione dei miociti cardiaci viene poi raggiunto da perfusione retrograda delle arterie coronarie con una specializzata a basso Ca ^{2 +} tampone contenente collagenasi. Atria, parete libera del ventricolo destro e il ventricolo sinistro possono essere separati da tecniche microchirurgiche. Il calcio è poi lentamente aggiunti ai cardiomiociti isolati in un passo multiplo comprendente procedura di lavaggio. Cardiomiociti atriali e ventricolari di aspetto sano senza contrazioni spontanee vengono immediatamente sottoposti ad analisi elettrofisiologiche dalla tecnica di patch clamp o altre analisi biochimiche nelle prime 6 ore dopo l'isolamento.

Protocollo

1. Animal Anestesia e prelievo di organi

1. Anestetizzare il mouse intraperitoneale (ip) iniezione di ketamina (200 mg / kg di peso corporeo) e TMA (20 mg / kg di peso corporeo).
2. Per anticoagulate iniettare 250 IP UI di eparina per evitare la coagulazione del sangue e la formazione di trombi.
3. Attendere fino narcosi viene raggiunto, che è caratterizzato da areflessia. Per verificare la presenza di areflessia, riflesso corneale prova toccando delicatamente la cornea o del volo reflex test pizzicamento coda.
4. Trasferire il mouse sul tavolo operatorio e fissarlo in posizione supina.
5. Incidere la pelle e la parete addominale al di sotto del xifoide ed eseguire toracotomia clamshell: estendere il taglio su entrambi i lati lungo l'arco costale e successivamente tagliare le costole nella linea ascellare mediale, deviare verso l'alto gabbia toracica.
6. Aprire pericardio, individuare grossi vasi. Premere delicatamente caudale cuore per visualizzare meglio l'aorta. Bloccare l'aorta con pinza.
7. Posizionare il cuore in concavità di una coppia di s cissors e sezionare tutte le navi di collegamento con un unico taglio. Assicurarsi di conservare una parte sufficientemente grande della aorta ascendente per incannulazione Langendorff.
8. Trasferire cuore staccato immediatamente ad una piastra Petri riempito con ghiaccio freddo e pre-ossigenato soluzione di 1 (per le soluzioni, vedi Tabella 1).

2. Preparazione di perfusione Cuore e Langendorff

1. Incannulare l'aorta con una cannula di acciaio 1.8F. Assicurati di evitare embolia gassosa.
2. Aorta fissarsi sulla cannula con una sutura chirurgica e coronarie filo con 1 ml di soluzione 1.
3. Collegare cannula con un apparato Langendorff.
4. Assicurarsi che il tempo di toracotomia per incannulazione Langendorff non supera i 120 secondi per evitare di estesa ischemia / riperfusione al miocardio.
5. Cuore profumato con 10 ml di soluzione di Ca ^{2 +} libero 2 (4 ml / min).
6. Cuore profumato con una soluzione di collagenasi 3 per 8 min (4 ml / min).

le "> 3. microchirurgica dissociazione del Cardiac Chambers

1. Cuore trasferimento in un pre-riscaldato a 100 mm piastra Petri contenente partire Ca ^{2 +} soluzione 4.
2. Rimuovere con attenzione aortica e altri non-tessuto cardiaco con le forbici e scartarla.
3. Atri e ventricoli separati e continuare con ciascuna camera separatamente. Mantenere le cellule immersi in soluzione al 4. Utilizzare piccoli volumi (meno di 5 ml).

4. Dissociazione ulteriore Cardiomyocytes

1. Cardiomiociti atriali:
   1. Per individuare cardiomiociti atriali trasferire gli atri in un apposito pre-riscaldata da 100 mm piastra di coltura e dissociare il tessuto attraverso delicatamente spinge via con una pinza sottile. Assicurare un dissociazione quasi completa del tessuto.
   2. Usare una pipetta da 1 ml con allargata fuoco lucidato punta di plastica pipetta per sospendere le cellule in 1 ml di soluzione di 5 per 5 min.
   3. Separare le cellule dai detriti utilizzando un filtro cella (200 maglia um).
   4. Aggiungere 5 ml di soluzione al 5 sospensione cellulare e centrifugare per 2 minuti a 16 xg a temperatura ambiente.
   5. Le seguenti operazioni sono gestite sotto una cappa di coltura cellulare. Eliminare il supernatante e risospeso il pellet in 5 ml di soluzione 6.
   6. Dopo sedimentazione per gravità per 10 min in una provetta da 15 ml, centrifugare per 1 min a 16 xg a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule a seconda della loro quantità in 1-5 ml di soluzione 6.
2. Cardiomiociti ventricolari:
   1. Sezionare la regione di interesse ventricolare sinistra con pinza sottile in 5 ml di soluzione 4.
   2. Sospendere cellule pipettando gentilmente finché la maggior parte delle cellule sono separate. Trasferire la soluzione cellulare dopo il filtraggio (200 maglia micron) in un tubo da 50 ml, si aggiunge un volume di 25 ml.
   3. Centrifugare per 2 minuti a 16 xg a temperatura ambiente.
   4. Le seguenti operazioni sono gestite sotto una cappa di coltura cellulare. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 25 ml disoluzione 6 e consentire la sedimentazione delle cellule per 10 min.
   5. Contare le cellule e rimuovere il surnatante, aggiungere 25-50 ml di soluzione 6 sulle cellule.

5. Preparazione di Cardiomyocytes per elettrofisiologia cellulare, biochimica o se gli studi

1. Per gli studi di elettrofisiologia, tenere i miociti in soluzione 6 in una provetta da 50 ml e inibire la sedimentazione.
2. Per studi biochimici, calcium imaging esempio, miociti piastra sul piatto laminina rivestite coltura cellulare (concentrazione finale di 20 pg / ml di laminina in PBS).
3. Per colorazione per immunofluorescenza preparare una coltura di piastra di cella piatto con vetrini coprioggetto rivestiti di vetro e con soluzione laminina (concentrazione finale di 50 pg / ml di laminina in PBS).
   1. Rimuovere la soluzione prima di miociti placcatura. Piastra le cellule e controllare la densità cellulare utilizzando un microscopio.
   2. Lasciare i miociti aderire fodera per 1 ora a 37 ° C in 2% di CO _2, rimuovere la soluzionee iniziare subito con un protocollo standard procedura di colorazione.
   3. Incubare con fissativo, ad esempio PFA 4% in PBS (pH 7,5) per 10 min a temperatura ambiente e seguire con tre passaggi di lavaggio PBS per 5 minuti ciascuna.
   4. Per permeabilizzare le cellule e di inibire l'anticorpo non specifico legame incubare i miociti con 10% di siero, 0,3% Triton, 0,2% BSA in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
   5. Incubare con l'anticorpo primario per 1 ora a 37 ° C e lavare come descritto prima.
   6. Incubare con l'anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente. Per i nuclei di contrasto e di α-actinina uso e fluorocromo DAPI falloidina coniugato (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
   7. Dopo il lavaggio, trasferire il coperchio di vetro scivola attentamente silano vetrini trattati e cellule embed in fluorescenza mezzo di montaggio.

6. Cellular Elettrofisiologia

1. Eseguire Whole-cell patch-clamp su FREshly isolati cardiomiociti atriali e ventricolari a temperatura ambiente.
2. Trasferire sani cardiomiociti compaiono nella camera di perfusione riempita con un volume definito della soluzione del bagno extracellulare. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH ₂ PO _4, 4 mM NaHCO _3, 1,7 mM MgCl _2, 3 mM CoCl _2, HEPES 10 mM, glucosio 10 mM, e 0,02 mM Tetrodotoxina (TTX), (pH 7,4) . Utilizzare NaOH per la regolazione del valore di pH.
3. Usare un equipaggiamento patch clamp (cioè IX71 microscopio invertito, un amplificatore Multiclamp 700B, una acquisizione Digidata 1440A sistema e PC con pClamp10.3 software (Molecular Devices)).
4. Utilizzare pipette patch con resistenze di 3-5 MW quando riempito con soluzione intracellulare contenente 130 mM KCl, 2 _mM MgCl2, 11 mM di HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na ₂ ATP, 0,4 mM Na ₂ GTP, 5 mM Na ₂ CP e 4,9 mM CaCl ₂ (pH 7,2). Utilizzare KOH per la regolazione del valore di pH.
5. Evoke verso l'esterno K + correnti duanello di 4,5 sec gradini di tensione per testare potenziali tra -60 e +50 mV a 10 mV, con incrementi da un potenziale di mantenimento di -70 mV dopo 20 msec prepulse a mV -40.
6. Assicurarsi di correnti di fuga sono sempre <100 pA.
7. Per la dissezione di K + diverse correnti di usare inibitori specifici come 4-aminopiridina (4-AP; Biomedicals ICN, Irvine, CA, USA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) o Tetraethylammonium (TEA, Sigma). Le soluzioni madre dovrebbero essere preparati in soluzione del bagno extracellulare, e applicato direttamente sulla zona più vicina possibile della cellula tramite una micropunta dopo "baseline" registrazioni. Equilibramento dovrebbe essere consentito per 2-3 minuti prima di "droga" registrazioni.
8. Per l'analisi normalizzare ampiezze attuali singole celle a dimensione della cella (a cellula intera capacità di membrana). Analizzare i dati non in linea utilizzando pClamp10.3 software (Molecular Devices) o software simile.

Risultati

Isolamento degli adulti cardiomiociti murini di topi geneticamente modificati per studiare la funzione dei geni di interesse specifico in vitro è diventato un potente strumento per capire meglio fisiopatologia cardiaca. Questo metodo è attualmente utilizzato da un numero piccolo ma crescente di base laboratori scientifici di tutto il mondo. Tuttavia, l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari murini adulti può essere difficile e deve essere fatto accuratamente e ripetutamente da mani esperte. Figur...

Discussione

Con lo sviluppo crescente di ceppi di topi geneticamente per studiare la funzione cardiaca e patologia cardiaca relativa a gene delezione c'è anche un crescente interesse per metodi specializzati per studiare gli effetti della delezione genica specifica in vitro. Nel nostro laboratorio studiamo i ruoli di una famiglia di Kv canale subunità accessorie sulla ripolarizzazione cardiaca. I geni KCNE comprendono una famiglia di 5 geni (KCNE1-5), che svolgono un ruolo importante in ventricolare u...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda
Tetrodotoxina	Alomone
4-amminopiridina	ICN Biomedicals
Heteropodatoxin 2	Alomone
Tetraethylammonium	Sigma Chemicals
Collagenasi di tipo 2	Worthington