Articolo metodologico

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di

DOI:

10.3791/50150

⸱

4 marzo 2013

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1Institute of Genetics, University of Mainz, 2Department of Anatomy and Neuroscience, University of Melbourne

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo una tecnica per l'etichettatura singoli neuroni nel sistema nervoso centrale (SNC) Drosophila Embrioni, che consente l'analisi della morfologia neuronale da una luce trasmessa o microscopia confocale.

Abstract

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In questo articolo viene descritto come etichettare singolarmente i neuroni del sistema nervoso centrale dell'embrione di Drosophila melanogaster mediante iniezione juxtacellular del DiI lipofilo fluorescente marker di membrana. Questo metodo permette la visualizzazione della morfologia delle cellule neuronali nei minimi dettagli. È possibile etichettare qualsiasi cella nel CNS: corpi cellulari dei neuroni bersaglio sono visualizzati sotto DIC ottiche o mediante espressione di un marcatore fluorescente genetico come GFP. Dopo etichettatura, la DiI può essere trasformato in un permanente macchia marrone da fotoconversione per permettere la visualizzazione della morfologia cellulare con luce trasmessa e ottica DIC. In alternativa, le cellule DiI-etichetta possono essere osservati direttamente con microscopia confocale, permettendo geneticamente introdotte proteine ​​reporter fluorescenti da colocalised. La tecnica può essere utilizzata in qualsiasi animale, indipendentemente dal genotipo, rendendo possibile analizzare fenotipi mutanti a risoluzione singola cella.

Introduzione

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La conoscenza della morfologia neuronale a livello delle singole celle è un presupposto fondamentale per la comprensione connettività neuronale e la funzione del SNC. Così, fin dai primi giorni di neuroscienze, i ricercatori hanno cercato di sviluppare singole tecniche di marcatura delle cellule (vedi 7 per una trattazione storica di questo numero). Metodi classici come colorazione di Golgi forniscono eccellente risoluzione di morfologia neuronale ma non sono adatti se si cerca di etichettare un particolare tipo di neurone in modo diretto, come colorazione avviene in modo casuale. Lo sviluppo di metodi per la colorazione di cellule singole mediante iniezio....

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Protocollo

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Abbiamo usato due varianti leggermente diverse del singolo metodo di etichettatura neurone nei nostri laboratori. Le differenze riguardano la raccolta degli embrioni, dechorionisation, devitellinisation e gradini sfilettatura embrioni. Figura 1 fornisce una panoramica dei passaggi comuni e divergenti delle varianti.

1. Preparazione di micro-aghi per la dissezione dell'embrione e Micropipette per iniezione Dye

  1. Aghi vetro per dissezione dell'embrione sono tratti da capillari di vetro (1 mm di diametro e 0,1 mm di spessore) con un estrattore Sutter (Science Instruments) o apparecchio analogo. In alternativ....

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Risultati

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La figura 4 illustra i risultati tipici della tecnica, si descrive qui. Figura 4A illustra un esempio di una piena interneurone DiI singolo che è stato pulito photoconverted. Si dimostra in modo esauriente la quantità di dettagli questi offrono preparazioni. Se visto sotto ottiche DIC contesto spaziale della cella etichettata all'interno del tessuto non marcato circostante diventa visibile, ad esempio, la posizione del corpo cellulare all'interno della corteccia e della.......

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Discussione

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Uno dei principali vantaggi di Drosophila come sistema modello è che permette l'analisi di sviluppo e funzione del livello di singole cellule. Questo è particolarmente utile per quanto riguarda il sistema nervoso, in cui la diversità di tipi di cellule è eccezionalmente elevata e la funzione e la morfologia delle cellule vicine può essere totalmente differente.

Il metodo qui presentiamo permette l'etichettatura dei singoli neuroni con un colorante che può essere trasformato .......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della DFG a GMT

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente / materiale Azienda Numero di catalogo Commenti
REAGENTI
DAB Sigma-Aldrich D-5905 2-3 mg / ml in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4
DiI Probes Invitrogen / Molecular D-282 1 mg / ml in etanolo
Formaldeide Merck Millipore 7,4% in PBS
Glicerina Roth 3783 70% in PBS
Eptano Colla Beiersdorf AG Cello 31-39-30 * diluire ca. 1 a 1 con n-eptano
PBS 1x
TRIS Roth 4855
Vectashield Vector Laboratories H1000
ATTREZZATURE
Microscopio confocale Leica TCS SP2 per visualizzare e documentare labelings in fluorescenza
DC - unmplifier Dragan Corporation Cornerstone ION-100 effettuare le labelings
Coprioggetto Menzel BB018018A1 18 x 18 mm
Coprioggetto Menzel BB024060A1 24 x 60 mm
Dissezione Microscopio Leica MZ8 per preparare e disect embrioni
Appartamento Capillari Hilgenberg diametro esterno 1 mm, spessore vetro 0,1 millimetri
Iniezione Capillari Scienza Prodotti GB 100 TF 8P
Micromanipolatore R Leica effettuare le labelings
Modello P-97 Sutter Instruments per tirare capillari
Oggetto Slides Marienfeld Superior 1000000
Microscopio scientifico Zeiss Axioskop 2 mot per visualizzare labelings dopo fotoconversione
Microscopio scientifico Olimpo BX50 effettuare le labelings
Sony MC3255 Videocamera Sony / AVT Horn Sony MC3255 registrare labelings dopo fotoconversione

Tabella 1.

Riferimenti

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  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  2. Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. Fr....

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Tag

Marcatura di singole celluleembrioni di Drosophilainiezione juxtacellularemarcatore fluorescente DiImicroscopia confocaletecnica di fotoconversionepattern di espressione della GFPmorfologia neuronalepreparazione dell embrione

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