Qui si descrive un metodo efficace per lo studio delle dinamiche di gioco cellulare per apoptosi In vivo. Questo metodo impiega vivere Drosophila Embrioni come un potente modello per il monitoraggio fagocitosi delle cellule apoptotiche mediante etichettatura specifica delle cellule apoptotiche e fagociti.
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Articolo metodologico
Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso
In questo articolo
Sommario
Abstract
La corretta eliminazione delle cellule indesiderate o aberrante attraverso l'apoptosi e la successiva fagocitosi (clearance cellulare per apoptosi) è cruciale per lo sviluppo normale in tutti gli organismi metazoi. Gioco cellulare per apoptosi è un processo altamente dinamico intimamente associato con la morte delle cellule, le cellule apoptotiche unengulfed sono a malapena visibili in vivo in condizioni normali. Al fine di comprendere le diverse fasi del gioco cellulare per apoptosi e per confrontare fagociti 'professionali' - macrofagi e cellule dendritiche a 'non professionale' - le cellule vicine tessuto residenti, imaging in vivo vivo del processo è estremamente utile. Qui si descrive un protocollo per lo studio di liquidazione cellulare per apoptosi in vivo embrioni di Drosophila. Per seguire le dinamiche delle diverse fasi della fagocitosi che utilizziamo marcatori specifici per le cellule apoptotiche e fagociti. Inoltre, siamo in grado di monitorare i due sistemi fagocita in parallelo: macrofagi 'professionali' e 'semi-profeglia ssional 'nel sistema nervoso centrale di sviluppo (SNC). Il metodo descritto qui impiega l'embrione di Drosophila come un ottimo modello per studi in tempo reale di gioco cellulare per apoptosi.
Introduzione
La corretta eliminazione delle cellule indesiderate o aberranti attraverso apoptosi e successiva fagocitosi è cruciale per lo sviluppo embrionale e per omeostasi tissutale nell'adulto. Fagocitosi delle cellule apoptotiche o di liquidazione per apoptosi è un processo altamente dinamico che si svolge in quattro fasi: (1) il reclutamento dei fagociti al cellulare per apoptosi ('find-me'), (2) il riconoscimento della cellula come un obiettivo per fagocitosi ( 'mangia-me') e (3) engulfment, seguito da (4) maturazione phagosome e la degradazione della particella apoptotico 1-5. Ci sono due tipi di fagociti:....
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Protocollo
Per seguire le dinamiche di gioco cellulare per apoptosi in vivo due popolazioni di cellule devono essere etichettati: fagociti e cellule apoptotiche.
Per contrassegnare le popolazioni di cellule fagocitarie che usiamo una linea Drosophila contenente il marcatore simulare cytGFP, che le etichette esclusivamente le cellule fagocitarie nell'embrione: macrofagi, cellule gliali e ectoderma 8. Si possono utilizzare diversi marcatori per i fagociti, comprese le linee che contengono un driver Gal4 hemocyte specifici (CRQ-Gal4) o glia-specifica Gal4 conducente (repo-Gal4) e un reporter f....
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Risultati
Fotogrammi rappresentativi di un film in cui le cellule apoptotiche sono marcate con annessina V, e glia, ectoderma e macrofagi sono etichettati con simu-cytGFP sono illustrati nella Figura 2. Ogni frame è una proiezione di 3 fette 2 micron ciascuna.
L'embrione di scena 15 è posizionato correttamente mostrando il SNC embrionali in mezzo con glia ben marcato (g). I macrofagi (m), che sono per lo più al di fuori del sistema nervoso centrale, mostrano una forte esp.......
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Discussione
Gioco cellulare per apoptosi è un ultima fase critica di apoptosi, che è altamente dinamico. Pertanto studi in tempo reale del processo sono di massima importanza. Qui si descrive un protocollo che consente il monitoraggio della clearance cellulare per apoptosi nello sviluppo di embrioni di Drosophila vivere. In questa procedura, due popolazioni di cellule devono essere marcati usando specifici marcatori: cellule apoptotiche e fagociti. Il giornalista simulare cytGFP è adatto per il monitoraggio dei ma.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa Marie Curie di reinserimento Grant (IRG249084). Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Kurant.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| < strong>Material | |||
| Tubo capillare | FHC | 30-30-0 | |
| Filtro cellulare | SPL | 93100 | |
| Pennello |
Riferimenti
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 78....
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Ristampe e permessi
