L'infezione della prostata può essere un fattore che contribuisce a mediare dolore pelvico in prostatite cronica. Descriviamo la procedura per la preparazione di standard inoculo batterico, l'instillazione di batteri nell'uretra di topi maschi e la metodologia per la misurazione allodinia tattile nei topi nel corso del tempo.
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Articolo metodologico
Misurazione della tattile Allodinia in un modello murino di prostatite batterica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Uropatogeni Escherichia coli (UPEC) sono agenti patogeni che svolgono un ruolo importante nelle infezioni delle vie urinarie e prostatite batterica 1. Abbiamo recentemente dimostrato che UPEC hanno un ruolo importante nell'avvio di dolore pelvico cronico 2, una caratteristica di prostatite cronica / sindrome dolorosa pelvica cronica (CP / CPPS) 3,4. L'infezione della prostata da parte UPEC clinicamente rilevante in grado di avviare e definire il dolore cronico attraverso meccanismi che possono comportare danni ai tessuti e l'avvio di meccanismi di autoimmunità 5.
Una sfida per comprendere la patogenesi della UPEC nella prostata è relativa inaccessibilità della prostata alla manipolazione. Abbiamo utilizzato un metodo precedentemente descritto infezione intrauretrale 6 per fornire un ceppo clinico di UPEC in topi maschi stabilendo, quindi un'infezione ascendente della prostata. Qui, descriviamo i nostri protocolli per uniformare le bacterial inoculo 7 nonché la procedura per la cateterizzazione anestetizzati topi maschi per instillazione di batteri.
CP / CPPS è principalmente caratterizzata dalla presenza di allodinia tattile 4. Test comportamento era basato sul concetto di iperalgesia cutanea risultante da cui 8-10 dolore viscerale. Un focus irritabile nei tessuti viscerali riduce la soglia del dolore cutaneo che consentano una risposta esagerata al normalmente non dolorosi stimoli (allodinia). Applicazione della forza normale al risultato pelle in risposte anomale che tendono ad aumentare con l'intensità del dolore viscerale sottostante. Descriviamo metodologia in NOD / ShiLtJ topi che utilizzano fibre di von Frey quantificare allodinia tattile nel tempo in risposta ad una singola infezione con batteri dell'UPEC.
Protocollo
1. Preparazione per l'inoculo batteri mouse
Devono essere effettuata in condizioni asettiche.
- Prendere una 17 x 100 provette di polipropilene mm con tappi e aggiungere 3 ml di brodo fresco Luria (LB) media. Con punte autoclave, prendere un po 'congelato stock in glicerolo batteri del ceppo CP1 2 e trasferire una piccola quantità della cultura nella provetta contenente il supporto LB. Sostituire il tappo del tubo in modo che l'ossigeno è ancora in grado di entrare nel tubo - la cultura ha bisogno di crescere in condizioni aerobiche. Tubo a 37 ° C in un incubatore agitazione a 220 rpm overnight.
- Il giorno successivo, trasferire 5 ml di coltura durante la notte in una nuova provetta con supporti ml 3 LB e crescere in condizioni statiche in un incubatore notte a 37 ° C.
- Il giorno 3 di trasferimento 40 microlitri della cultura in aa tubo da 50 ml contenente 40 ml ciascuno dei media LB. Mettere in una notte a 37 ° C statico incubatore.
- Accendere e impostare centrifuga a 4 ° C.Una volta che ha raggiunto la temperatura centrifuga finale, trasferire ogni 40 ml di coltura in una provetta da centrifuga 40 ml Nalgene.
- Pesare tubi per bilanciare centrifuga - regolare il volume con i media LB, se necessario. Spin tubi a 6.000 rpm per 20 min.
- Rimuovere con attenzione il surnatante e delicatamente sospendere pellet batterico in 40 ml di PBS sterile.
- Ripetere il punto 1.5 con PBS.
- Aspirare il surnatante e sospendere off batteri in 500 microlitri di PBS sterile. Trasferire la soluzione in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Prelevare 10 ml di sospensione e diluire in 990 ml di ghiacciata PBS. Usare uno spettrofotometro per leggere le OD 420 nm per determinare il volume necessario per inoculazione. Per determinare il volume appropriato di ghiacciata PBS di sospendere pellet in: Prendere l'OD 420 nm numero (in ml) e sottrarre il volume stimato del pellet batterico [es. OD 420 nm = 0,545, pellet di circa 0,075 ml. 0,545-0,075 = 0,470].
- Rimuovere 10 pl di sospensione di batteri e diliuto nel 990 microlitri ghiacciata PBS. Leggi le nm 420 OD. L'obiettivo è quello di raggiungere un valore di nm OD 420 per la sospensione diluita di 1.000 ± 0,010. Se il numero della diluizione è al di sopra di tale obiettivo, aggiungere più volume alla sospensione e prendere un'altra lettura. Se il numero è inferiore al 0,990 poi centrifugare la sospensione e ripetere la lettura OD 420 nm fino ad ottenere lettura desiderata.
2. L'infezione degli animali
Mice (5-7 settimane di vita, dieci per gruppo) sono stati acquistati dalla Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
- I topi vengono anestetizzati per inalazione del 1-4% isoflurano in una camera di plexiglas e sono controllati fino a quando reclinata.
- Un mouse alla volta viene preso per instillazione di batteri tramite cateterismo con polietilene (PE10) catetere attaccato ad un ago 30 G modificata di una siringa Hamilton vetro (lunghezza di 1,5-2,0 cm). Il catetere viene inserito al mozzo dell'ago. Il mouse è placed sulla sua superficie dorsale in anestesia mantenute usando un cono.
- Il pene del mouse viene estrusa con una leggera pressione e la quantità di lubrificante liberali su tamponi di cotone viene utilizzato per la lubrificazione di l'ingresso dell'uretra peniena.
- 10 pl di PBS contenente 1 x 10 8 batteri viene introdotto nell'uretra di topi anestetizzati dopo cateterizzazione.
- I topi vengono mantenuti in uno stato anestetizzato per 15 min nella camera plexiglas dopo introduzione batterica per consentire attacco batterico e di prevenire la minzione immediata.
- I topi vengono rimesse nelle loro gabbie e monitorato per le successive 24 ore.
3. Comportamento Test
I topi sono stati testati prima dell'infezione (basale) e nei giorni 3, 7, 14, 21 e 28 dopo l'infezione. Cui iperalgesia e allodinia tattile è stato testato utilizzando von Frey filamenti applicato sull'addome 11,12 e il r plantareEgion della zampa posteriore 13. Il test è stato perfomed in un determinato momento della giornata, metodologia standard e test sperimentatore unico di tutti gli animali sono stati impiegati. Accecato test dei gruppi è stato utilizzato per combattere le limitazioni di comportamento basato su test del dolore in modelli animali. Cinque filamenti singoli von Frey con forze di 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 e 4,0 g (Stoelting, USA) sono stati applicati al ventre e frequenza delle risposte ritiro è stato calcolato.
- Dopo un periodo di 30 minuti di acclimatazione, i topi sono posti in camere singole plexiglas (6 x 10 x 12 cm) realizzati in casa con un pavimento in acciaio griglia di filo di acciaio.
- Riferito iperalgesia e allodinia tattile sono stati testati utilizzando i cinque filamenti di von Frey. Ogni filamento è stato applicato per 1-2 sec con un inter-stimolo intervallo di 5 secondi per un totale di 10 volte, ed i peli sono stati testati in ordine crescente di forza.
- Ogni filamento è applicato alla zona addominale inferiore in prossimità generale della prostata ecura è stata presa per stimolare diverse aree all'interno di questa regione per evitare di desensibilizzazione o "liquidazione" effetti. Filamenti sono stati applicati in ordine crescente di forza per 1-2 secondi con intervalli di almeno 5 secondi tra stimoli per un totale di 10 volte.
- Tre tipi di comportamento sono considerati una risposta positiva alla stimolazione filamento: 1) retrazione acuto dell'addome; 2) leccare immediata o graffiare dell'area di stimolazione filamento; 3) salto.
- Risposta in frequenza è stata calcolata come percentuale di risposta positiva (di 10, ad esempio 5 risposte di 10 = 50%) e di dati è stata riportata come percentuale media di risposta in frequenza ± SE
- Animali con più di 25 risposte positive totale basale sono esclusi dallo studio.
- Allodinia tattile è stato testato sulla regione plantare della zampa posteriore con filamenti di von Frey con le forze di 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 e 4,0 g. La soglia media di ritiro al 50% (5) è stata valutata utilizzando il up-downmetodo in cui è stato avviato il test con 0,04 g filamento applicata perpendicolarmente alla superficie plantare della zampa posteriore finché il filamento leggermente piegate. Filamenti sono stati testati in ordine ascendente fino una risposta positiva è stata osservata. Una risposta positiva al filamento è stata definita come un brusco ritiro della zampa o leccare della zampa test. Quando una risposta positiva è stata registrata successivo filamento più debole è stato applicato, e se una risposta negativa è stata osservata, quindi il successivo filamento forte è stato applicato.
- Gli esperimenti e le metodologie descritte sono stati esaminati e approvati dalla cura degli animali Northwestern University e utilizzare comitato.
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Risultati
Abbiamo esaminato topi NOD / ShiLtj e maschi C57BL/6J per la presenza di dolore cronico dopo infezione batterica. Topi maschi (5 a 7 settimane di età) sono stati instillati con soluzione salina o batteri nell'uretra (Figura 1). Stimolazione meccanica della zona pelvica con von Frey filamenti di soluzione salina-instillato topi C57BL/6J e UPEC topi infettati C57BL/6J portato ad una risposta in frequenza che non è cambiato durante i 28 giorni di corso dell'esperimento (Figura 1).
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Discussione
Infezione della prostata mouse con UPEC consente la modellazione in vivo di eventi che possono essere coinvolte nella patogenesi della prostatite batterica, CP / CPPS o come un evento predisponente infiammazione cronica. I metodi descritti per la preparazione di batteri e instillazione pareggio su un vasto corpo di letteratura sui modelli UPEC nelle infezioni del tratto urinario femminile 7,14. Il modello dispone di ampia applicabilità per studiare la patogenesi, la sperimentazione vaccini candidati ...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni 1K01DK079019A2 (PT) dal NIH / NIDDK.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| Cultura tubi | BD Falcon | 352059 | |
| LB Broth Miller | EMD | EM1.10285.0500 | |
| Tubi per centrifuga Nalgene | Thermo | 3118-0050 | |
| Isoflurano | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Catetere ago 30G | Hamilton | 91030 | |
| PE10 tubi | BD intramedic | 427400 | |
| Von Frey filamenti | Stoelting | 58025-31 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
