Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Sommario

Complessi proteici catalizzano le funzioni cellulari fondamentali. Caratterizzazione funzionale e strutturale dettagliata di molti complessi essenziali richiede la produzione ricombinante. MultiBac è un sistema di celle di baculovirus / insetto particolarmente adattato per esprimere proteine ​​eucariotiche e dei loro complessi. MultiBac è stato implementato come una piattaforma open-access, e le procedure operative standard sviluppati per massimizzare la sua utilità.

Abstract

Ricerca proteomica ha rivelato l'impressionante complessità del proteoma eucariotiche in dettaglio senza precedenti. Ora è un concetto comunemente accettato che le proteine ​​nelle cellule esistono per lo più non come entità isolate, ma esercitano la loro attività biologica in collaborazione con molte altre proteine, nell'uomo dieci o più, formando catene di montaggio della cella per la maggior parte se non tutte le funzioni vitali. ^{1 , 2} Conoscenza della funzione e l'architettura di queste assemblee multiproteici richiede la loro disposizione in una qualità superiore e la quantità sufficiente per l'analisi dettagliata. La scarsità di molti complessi proteina nelle cellule, in particolare negli eucarioti, vieta loro estrazione da fonti native, e richiede la produzione ricombinante. Il sistema di vettore di espressione di baculovirus (BEVS) ha dimostrato di essere particolarmente utile per produrre proteine ​​eucariotiche, la cui attività si basa spesso su elaborazione post-traduzionale che altri sistemi di espressione comunemente usati spesso puònon supportano. ³ BEVS utilizzare un baculovirus ricombinante in cui è stato inserito il gene di interesse per infettare colture cellulari di insetto che a loro volta producono la proteina di scelta. MultiBac è un BEVS che è stato particolarmente su misura per la produzione di complessi di proteine ​​eucariotiche che contengono molte subunità. ⁴ Un prerequisito fondamentale per una produzione efficiente di proteine ​​e loro complessi sono protocolli affidabili per tutte le fasi coinvolte in un esperimento di espressione che idealmente può essere implementato come procedure operative standard (SOP) e seguito anche da utenti non specializzati con relativa facilità. La piattaforma MultiBac al Laboratorio europeo di biologia molecolare (EMBL) utilizza POS per tutti i passaggi necessari per un multiprotein esperimento un'espressione complessa, a partire dalle inserimento dei geni in un genoma baculoviral ingegnerizzato ottimizzato per la produzione di proteine ​​eterologhe proprietà di analisi su scala ridotta della proteina esemplari prodotti. ^5-8 La piattaforma diè installato in una modalità di accesso aperto presso l'EMBL di Grenoble e ha supportato molti scienziati del mondo accademico e industria per accelerare i progetti di ricerca complessi proteici.

Introduzione

Attività biologica è controllata da gruppi di proteine ​​e altre biomolecole che agiscono di concerto per catalizzare le funzioni cellulari. Tipici esempi sono i macchinari che trascrive l'informazione ereditaria contenuta nel DNA in RNA messaggero. Negli esseri umani, più di 100 proteine ​​si uniscono in un processo definito e disciplinato a trascrivere i geni, formando grandi complessi multiproteici con 10 e più subunità tra RNA polimerasi II e dei fattori di trascrizione generali come TFIID, TFIIH e altri. ⁹ Altri esempi sono il ribosoma, composto di molte proteine ​​e molecole di RNA, che catalizza la sintesi proteica, o il complesso nucleare del p....

Protocollo

1. Recombineering Tandem (TR) per la creazione di multigenica costrutti di espressione

1. Pianificare la strategia di co-espressione. Approccio progettuale per l'inserimento dei geni di interesse in donatori e accettori. Potenziali moduli fisiologici del vostro complesso dovrebbero essere raggruppati insieme su Aderenti ei donatori specifici. Utilizzare Modulo Moltiplicazione composto da endonucleasi Homing (HE) - coppie BstXI combinare cassette di espressione sul singolo donatore e plasmidi Acceptor ^7,8 Crea tutti i costrutti rilevanti in silico e validare accuratamente la strategia prima di procedere al lavoro sperim....

Risultati

Forte co-espressione di proteine ​​eterologhe raggiunti dal sistema MultiBac è mostrato in Figura 1d (sonde prelevati 48 ore dopo infettare una coltura cellulare di sospensione). Le bande proteiche sono overexpressed chiaramente distinguibile nell'estratto cellula intera (SNP) e il lisato eliminato (SN). La qualità e la quantità del materiale di proteina prodotta è spesso sufficiente a consentire la determinazione della struttura di complessi proteici, come il punto di arresto mitotico complesso MCC.......

Discussione

Video istantanee delle figure 2 e 3 illustrano l'intero processo di generazione robot-assistita da cDNA di espressione multigene costruisce fino alla infezione di colture cellulari di insetto per la produzione di proteine. Nuovi reagenti (plasmidi e virus) e protocolli robusti sono stati sviluppati per consentire una pipeline basandosi su SOP. L'intera filiera è stato implementato come una piattaforma tecnologica al EMBL di Grenoble. La piattaforma MultiBac è stata letta da molt.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetraciclina	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1.000X a 10 mg/ml
Kanamicina	Euromedex	EU0420 (25 g)	1.000X a 50 mg/ml
Gentamicina	SIGMA	G3632 (5 g)	1.000X a 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1.000X a 1M
Cre-ricombinasi	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP reagente di trasfezione	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
Piastra a 6 pozzetti Falcon	Dominique Dutscher	353046
Pipetta da 2 ml Falcon	Dominique Dutscher	357507
Pipetta da 5 ml Falcon	Dominique Dutscher	357543
pipetta da 10 ml Falcon	Dominique Dutscher	357551
pipetta da 25 ml Falcon	Dominique Dutscher	357535
pipetta da 50 ml Falcon	Dominique Dutscher	357550
tubo da 50 ml Falcon	Dominique Dutscher	352070
tubo da 15 ml Falcon	Dominique Dutscher
1,8 ml criotubo Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml Pyrex	Dominique Dutscher	211918
2 L Pyrex	Dominique Dutscher Dutscher
Certomat Agitatore Orbitale + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Serbatoio di azoto liquido dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Armadio di Sicurezza Biologica Faster	Sodipro	FASV20000606
Microscopio Ottico	Zeiss	451207
Sf21 Cellule
di insettoHi5 Cellule per insetti	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO in esecuzione Evoware plus	TECAN
10 μ l. punte conduttive (nere),	TECAN	10 612 516
200 μ l puntali conduttivi (neri)	TECAN	10 612 510
trogolo monouso per reagenti, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, bordato	Eppendorf	0030 128.648
96 pozzetti V fondo, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate colore naturale, PP)	Fisher	M3752M
PS micropiastra, 96 fondo piatto Greiner		655101
96 piastra a pozzetti profondi	Thermo scientific	AB-0932
blocchi da 24 pozzetti RB	Qiagen	19583
enzima di restrizione DpnI	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	fatto in casa		7,5% glicerolo, 0,031% blu di bromofenolo, 0,031% xilen cianolo FF
Scala di massa ad alto DNA per e-gel	Life Technologies	10496-016
Scala a bassa massa di DNA per e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarosio GP	Life Technologies	G8008-01
Kit di plasmidi Nucleo Spin-robot-96	Macherey Nagel	740 708.24
Kit di pulizia PCR, Estratto di Nucleospin Robot-96	Macherey Nagel	740 707.2
Master mix verde Gotaq	Promega	M7113
T4 DNA polimerasi, qualificato LIC	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	fatto in casa
Urea 2 M	fatto in casa
500 mM pH 8.0	Brodo LB fatto in casa
(Miller) 500 g	Athena ES	103

352096 500 ml Pyrex Dominique Dutscher 211919 211921 EDTA